Caracterização molecular e expressão heteróloga do alérgeno fosfolipase A1 do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera; Vespidae) - Pereira, Franco Dani Campos [UNESP] (2012)
Polybia paulista é uma vespa pertencente à ordem Hymenoptera muito comum no Sudeste do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo. Os venenos destes insetos são constituídos por aminas, peptídeos, proteínas de alta massa molecular, sendo estas na sua maioria, enzimas. As fosfolipases são as enzimas de maior abundância entre os alérgenos de veneno dos Hymenoptera sociais, constituindo-se também no alérgeno de maior importância. A sequência completa de 985 pb do cDNA da fosfolipase A1 do veneno da vespa P. paulista foi determinada a partir da clonagem. A proteína deduzida por tradução apresentou 302 resíduos de aminoácidos, PI e MW teóricos de 9,1 e 33 kDa respectivamente. Por meio de ferramentas de bioinformática foi possível identificar o sítio ativo entre os resíduos 131 a 140 (10 aminoácidos) e inferir que se trata de uma proteína da super família das esterases lipases. O cDNA completo foi clonado em vetor de expressão pET-28a em cepas de Escherichia coli BL21–DE3. A PLA1-Rec com cauda de 6x Histidinas no N- terminal foi expressa na forma insolúvel em corpúsculos de inclusão por meio da indução com 1mM de IPTG à 20°C por 6 horas. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina agarose-Ni+2 sob condições desnaturantes na presença de 8 M de uréia e a proteína eluida com tampão gradiente decrescente de pH. As análises de Western blotting revelaram a especificidade dos anticorpos policlonais produzidos em camundongos contra a fração eletroforética de PLA1 natural quando testados com o veneno bruto da própria vespa e com a PLA1- Rec de P. paulista. Além disto, estes anticorpos apresentaram imunoreatividade cruzada com o veneno bruto de outras vespas sociais testadas neste trabalho. Outras proteínas detectadas na membrana de nitrocelulose evidenciaram o reconhecimento dos...