Co-purificação e caracterização das fosfatase e fitase alcalinas de Rhizopus microsporus var. microsporus produzidas em fermentação submersa - Ornela, Pedro Henrique de Oliveira [UNESP] (2017)
A investigação biotecnológica, acompanhada da aplicação das enzimas, tem sido realizada em microrganismos para a produção de enzimas para fins industriais. Entre estas enzimas, as fosfatases, responsáveis por hidrolisar ésteres e anidridos de ácido fosfórico, e as fitases microbianas, que catalisam a hidrólise do fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) em mio-inositol e fosfato inorgânico, têm sido amplamente utilizadas em diferentes setores como, por exemplo, em experimentos de biologia molecular e na alimentação animal. De acordo com o pH ótimo de reação, as fosfatases são divididas em alcalinas (EC 3.1.3.1) e ácidas (EC 3.1.3.2). As fitases são enzimas que também pertencem à classe das fosfatases, hidrolisando, no entanto, de forma específica, o ácido fítico. Em recentes trabalhos, o fungo filamentoso Rhizopus microsporus var. microsporus apresentou potencialidade na produção de fosfatases e fitases. Diante disto, este estudo visou a produção, a purificação e caracterização da fosfatase e da fitase alcalina produzidas por R. microsporus var. microsporus. No processo de otimização em Fermentação Submersa (FSbm), a maior produção enzimática foi em meio Khanna com 0,4 mM de KH2PO3 e adicionado de 0,5% de farinha de centeio por 76 h, 32ºC, pH 6,3, a 100 rpm. Em colunas cromatográficas, a fosfatase alcalina foi purificada 10 vezes e com recuperação de 13%, e a fitase alcalina foi purificada 86 vezes com recuperação de 167%. A massa molecular nativa da fosfatase e da fitase alcalinas produzidas por R. microsporus var. microsporus foi de 122,7 e 55,5 kDa, respectivamente. A fosfatase alcalina purificada apresentou temperatura ótima de atividade de 45ºC e pH ótimo de 8,5, mantendo sua atividade catalítica acima de 60% nas temperaturas de 40 e 45ºC por até 210 min. Manteve sua atividade acima de 50% em pH alcalinos por até 24 horas. A fitase alcalina purificada apresentou temperatura e pH ótimos de atividade de 65ºC e 9,5, respectivamente. A fitase alcalina manteve sua atividade enzimática acima de 60% nas temperaturas de 65, 70 e 80ºC por 270 min. Após incubação da fitase em valores de pH alcalinos por 3 horas, houve aumento da atividade enzimática em até 50%. A fosfatase teve sua atividade aumentada na presença de 0,4 mM de FeCl3, e melhor hidrolisou o substrato p-nitrofenilfosfato, seguido pelo ATP. O Km para a fosfatase alcalina utilizando o substrato p-nitrofenilfosfato na ausência e na presença de FeCl3 foi 0,449 mM e 0,382 mM, respectivamente. Para a fitase alcalina o Km foi 0,413 mM utilizando fitato de sódio como substrato. Deste modo, a fosfatase e a fitase alcalinas produzidas por R. microsporus var. microsporus foram co-purificadas e bioquimicamente caracterizadas, evidenciando-se importantes características de ambas as enzimas possibilitando, assim, futuras aplicações industriais.