Caracterização molecular de RNAs teloméricos não codantes em Leishmania major - Morea, Edna Gicela Ortiz (2018)
Os protozoários do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada, que se apresenta de diferentes formas clínicas e que acomete milhões de pessoas no Brasil e no mundo. Até o momento não existe nenhuma vacina ou tratamento eficientes para leishmaniose e por isso, estudos que contribuam para o entendimento da biologia e fisiologia do parasito podem fornecer uma possibilidade de encontrar novos alvos terapêuticos. Este é o caso dos telômeros, cuja função principal é manter a estabilidade do genoma que se perturbada pode afetar diretamente a proliferação ou multiplicação dos parasitos. Os telômeros são estruturas nucleoprotéicas localizadas nas extremidades dos cromossomos, mantidos pela enzima telomerase. Eles são regulados por diversos processos entre os quais se encontram alguns longos RNAs não codificadores (lncRNA). Entre os lncRNAs com função telomérica está o TER (RNA Telomerase) o qual é um dos principais componentes do complexo telomerase, pois contém uma pequena sequência molde a qual é copiada pela telomerase durante a replicação dos telômeros, o TER foi recentemente identificado em Leishmania spp., porém se desconhece a sua função e biogênese. Outro RNA não codificante com função telomérica é o TERRA (Repetições Teloméricas contendo RNA), os quais são essenciais para a manutenção dos telômeros. Até o momento, identificamos a presença do TERRA expressos a partir das extremidades cromossômicas nas diferentes fases de desenvolvimento (amastigota, promastigota e metacíclica) do parasito. Para isso, utilizamos bibliotecas SL-Seq independentes construídas a partir de RNA total das três formas do parasito, em busca de transcritos que apresentassem o sinal da sequência líder (SL) posicionada a montante das repetições subteloméricas, como um marco que determina o processo de maturação do RNA mensageiro. Além do sinal SL, foi identificada a existência de elementos subteloméricos conservados em Leishmania, denominados CSB (Conserved Sequence Boxes), e ilhas CpGs putativas. Usando esta abordagem nós encontramos 7 classes diferentes de extremidades cromossômicas em L. major. Os resultados obtidos in silico foram validados experimentalmente utilizando Northern blot e RT-PCR. Foi confirmada a existência de transcritos TERRA com tamanho e número variável e expressão diferenciada entre as diferentes formas de desenvolvimento. No entanto, esses transcritos foram identificados em alguns cromossomos e não em todos, confirmando os resultados obtidos in silico. Transcritos TERRA maduros poliadenilados originados de alguns cromossomos também foram identificados nas três formas do parasito. Além disso, foi analisado o comprimento dos telômeros em um ciclo de desenvolvimento e nas fases promastigotas e metacíclicas mantidas in vitro até 6 repiques sucessivos (passagem 1-6). Os resultados mostraram que durante um ciclo de desenvolvimento as formas amastigotas apresentam telômero mais curtos que as formas promastigota e metacíclica derivadas da mesma, e que o tamanho dos telômeros diminui progressivamente nas formas promastigotas e metacíclicas delas derivadas, durante repiques sucessivos in vitro. Também observamos que nos parasitos que apresentam encurtamento progressivo dos telômeros se detecta aumento dos níveis de transcritos TERRA. Portanto, esses resultados sugerem que i) há regulação da expressão de TERRA em nível transcricional nos telômero durante o desenvolvimento de L. major, ii) o TERRA pode estar diretamente envolvido com a manutenção dos telômeros nesses parasitas, talvez regulando negativamente a atividade da telomerase e que iii) provavelmente as formas promastigotas e metacíclicas delas derivadas entram em senescência replicativa após vários ciclos de duplicação in vitro. Em relação à identificação das ilhas CpGs putativas em posição subtelomérica, foram realizadas inicialmente análise de metilação de DNA baseado na utilização de enzimas de restrição bloqueadas por metilação. Os resultados sugerem que estas regiões podem estar metiladas, porém ensaios de tratamento de bissulfito seguido de sequenciamento não confirmaram estes achados. Em relação ao componente RNA da telomerase, TER, para ajudar no entendimento da sua função na biologia do parasito, o gene foi inicialmente clonado e sequenciado para posteriormente ser subclonado em vetor de expressão em Leishmania spp. para realizar as análises funcionais. Um vetor utilizando a metodologia CRISPR/Cas9 para edição do TER no genoma de L. major foi desenhado e está em fase de construção. Também foi padronizada a utilização de oligonucleotídeos antisenso do tipo morpholinos, como ferramenta capaz de abolir a maturação do mRNA TER. Esta metodologia é uma ferramenta muito importante para a realização de knockdown em Leishmania spp., pois somente poucas espécies destes parasitos possuem maquinaria de RNA de interferência.