Perfil proteômico salivar e degradação de histatinas em indivíduos com síndrome de Down e doença periodontal - Domingues, Natalia Bertolo (2019)
O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil proteômico e a proteólise da histatina 1 e da histatina 5 na saliva total estimulada de indivíduos com síndrome de Down (SD) e não-sindrômicos (NS) na presença e na ausência da doença periodontal (DP). Foram selecionados 24 indivíduos, os quais foram divididos em 4 grupos experimentais (n=6): SD com DP (SDcDP), SD sem DP (SDsDP), não sindrômicos com DP (NScDP) e não sindrômicos sem DP (NSsDP - controle). Inicialmente, os participantes passaram por exame clínico intra-bucal para avaliação da condição periodontal e determinação do índice CPO-D. Foi realizada a coleta da saliva estimulada até a obtenção de 3,0 mL. Parte da saliva foi utilizada para a análise microbiológica e parte foi centrifugada para obtenção do sobrenadante da saliva total (SST), aliquotada e armazenada em freezer -80ºC para as análises proteômica e de degradação. Os níveis salivares de Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis foram quantificados pela Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR). A análise espectrométrica foi realizada com os pools de saliva de cada um dos quatro grupos, os quais foram submetidos a nLC-ESI-MS/MS (Cromatografia Líquida por ionização electrospray Tandem Espectrometria de Massas). A degradação proteica foi realizada pela adição de histatina 1 e histatina 5 sintéticas ao SST diluído (1:10) e incubação à 37ºC pelos tempos 0, 0,5, 1,5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas. Em seguida, foram realizadas as análises de eletroforese em gel de policrilamida (PAGE) catiônica e mensuração da densidade das bandas (%) das imagens obtidas. Os dados clínicos e microbiológicos foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis, complementado pelo teste de Dunn, e os dados de proteína total e degradação das histatinas foram avaliados por Anova seguida pelos pós-testes de Tukey e Bonferroni, respectivamente (=0,05). Os espectros obtidos na análise proteômica foram confrontados com base de dados específica e apresentados de forma descritiva. Os indivíduos com SD apresentaram redução significativa no fluxo salivar (p=0,001). Não houve diferença significativa para o índice CPO-D entre os grupos (p=0,158), enquanto que para os parâmetros periodontais diferenças estatísticas foram observadas, entre os grupos sem DP e com DP (p≤0,003). Com relação a quantidade de bactérias periodontopatogênicas, não houve diferença entre os grupos para Aa (p=0,803), por outro lado, níveis significativamente aumentados de Pg foram verificados no grupo NScDP em comparação aos grupos sem DP (p=0,022). A concentração de proteína total foi significativamente maior no grupo SDcDP (p≤0,0001). Um total de 1855 proteínas foram identificadas nas amostras de pool de saliva, sendo 31 comuns para os quatro grupos, porém com diferentes abundâncias, 11 exclusivas para os indivíduos com SD e 33 exclusivas para a DP. A degradação das histatinas 1 e 5 foi maior na presença da DP (p≤0,0001). A densidade das bandas sofreu influência do período de incubação (p≤0,0001) e do tipo de histatina (p≤0,0001), sendo observada maior taxa de degradação quanto maior o período de incubação e para a histatina 5 comparada à histatina 1. Além disso, foi observada uma maior taxa de degradação da histatina 1 na presença da SD (p=0,036). Pode-se concluir que: (1) existem diferenças de abundância de algumas proteínas na presença da SD e da DP, (2) a histatina 1 é mais resistente à proteólise do que a histatina 5, e (3) a degradação das histatinas 1 e 5 ocorre mais rapidamente na presença da DP e apenas a degradação da histatina 1 sofre influência da presença da SD.