Efeitos de diferentes ácidos graxos na expressão de transcritos envolvidos na síntese de PGF2α e PGE2 e no reconhecimento materno fetal em células trofoblásticas e embriões bovinos - Bezerra, Lucas Oliveira (2024)
A mortalidade embrionária precoce (MEP) ocasionada por falhas no reconhecimento materno da prenhez (RMP), entre os dias 15 e 17 após a fecundação, constitui uma das maiores causas de falhas reprodutivas em fêmeas bovinas. Estratégias para favorecer o RMP durante tal período crítico, baseiam-se na redução da síntese de prostaglandina F2α (PGF2α) pelo endométrio materno e/ou na maximização do estímulo anti-luteolítico induzido pelo concepto, incluindo o aumento da síntese de prostaglandina E2 (PGE2) e interferon-tau (IFNT). A PGE2 sintetizada pelo endométrio materno, embrião e células trofoblásticas desempenha efeitos luteotróficos e anti-luteolíticos; favorecendo o RMP. A adição de diferentes ácidos graxos em cultivos celulares modifica a biossíntese de eicosanóides, inclusive da PGE2 e PGF2α. A hipótese é que a suplementação com ácido linoleico conjugado (CLA), ácido linoleico (AL), ácido oleico (AO) e ácido eicosapentanóico (EPA) associado ao ácido docosahexaenóico (DHA) aumenta a síntese de PGE2, diminui a síntese de PGF2α e aumenta a razão PGE2/PGF2α em células trofoblásticas bovinas (CT-1); modifica a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de PGE2 e PGF2α em CT-1 e embriões bovinos produzidos in vitro; altera a expressão de transcritos que favorecem o RMP em CT-1 e embriões, além de favorecer o nível de metilação do DNA nos embriões. Assim, objetivou-se com o Experimento 1: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na síntese de PGE2, PGF2α e na razão PGE2/PGF2α em CT-1; b) avaliar a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGER4, PTGS2, PTGES2, PTGES, AKR1B1) e no RMP (IFNT) em CT-1. Assim, objetivou-se com o Experimento 2: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGS2, PTGES e AKR1B1), no RMP (IFNT) e no nível de metilação do DNA (DNMT3A) em embriões bovinos produzidos in vitro e b) avaliar a taxa de produção embrionária com 7 e 9 dias de cultivo. No Experimento 1, CT-1 em placas de 6 poços contendo meio acrescido com 10% de soro fetal bovino (SFB), onde foram cultivadas a 38,5°C com 5% CO2 por 5 dias. As CT-1 receberam meio de cultivo isento de SFB por 24 horas. Em seguida, os poços receberam meio sem SFB contendo 100 µM de CLA, 100 µM de AL, 100 µM de AO ou 50 µM de EPA + 50 µM de DHA durante 5 minutos e 24, 48 e 72 horas. Ao término do cultivo o meio foi coletado e as CT-1 foram lisadas com 1mL/poço de Trizol para posterior extração do RNA. As concentrações de PGE2 e PGF2α mensuradas por ELISA e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 5 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada pelo PROC MIXED do SAS, considerando o poço a unidade experimental. No Experimento 2, folículos ovarianos de 2 a 10 mm provenientes de fêmeas Nelore abatidas, foram aspirados utilizando seringa de 10 mL e agulha 18G. Oócitos com citoplasma homogêneo e múltiplas camadas de células do cumulus foram submetidos à maturação in vitro (MIV) em gotas de 100 μL contendo meio MIV com 5% de soro fetal bovino (SFB) sob óleo mineral, em incubadora a 38,5oC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 por 24 horas. Após a MIV, os oócitos foram submetidos a fertilização in vitro (FIV), com sêmen de uma única partida de mesmo touro Nelore, durante 18 horas nas mesmas condições da MIV (D0 = dia da FIV). Após a FIV, os prováveis zigotos (n = 1117) foram alocados em placas de 4 poços com 700 L de meio de cultivo/poço com 1,25% de SFB, acrescidos dos seguintes tratamentos: 100 μM de ácido linoleico conjugado (Grupo CLA; n = 223 oócitos); 100 μM de ácido linoleico (Grupo AL; n= 227); 100 μM de ácido oleico (Grupo AO; n = 225) ou 50 μM de ácido eicosapentaenóico - EPA + 50 μM ácido docosahexaenóico – DHA (Grupo EPA + DHA; n= 219); além de meio não acrescido de AG (Grupo Controle; n = 223). A produção embrionária foi avaliada no D7 e D9. Os embriões foram coletados no D9 e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 10 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada utilizando o software PROC MIXED do SAS. No experimento 1, não houve diferença para a síntese de PGE2 e PGF2α no tempo de 5 min entre os diferentes grupos. Os grupos tratados com AL quando comparado ao controle apresentou maior (P < 0,001) síntese de PGE2 com 24 horas (301,19  61,83 vs. 45,59  4,00 ng/mL; respectivamente), 48 horas (272,42  56,82 vs. 48,15  6,59 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (310,58  81,54 vs 97,40  22,40 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi maior (P < 0,001) nos grupo AL e AO quando comparados ao controle nos tempos de 24 horas (151,67  17,01 e 105,71  30,86 vs. 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente), 48 horas (112,94  40,95 e 159,41  43,67 vs 80,10  19,10 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (317,67  55,52 e 200,81  20,39 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi menor (P < 0,001) no grupo EPA + DHA quando comparado ao controle com 48 horas (7,28  0,54 vs 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (11,07  0,71 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A razão PGE2/PGF2α foram maiores (P = 0,007) nos grupos CLA, AL, EPA + DHA comparados ao grupo controle para 24 (2,23 + 0,31; 2,04 + 0,40 e 2,32 + 0,31 vs 1,11 + 0,15; respectivamente), 48 (3,16 + 0,68; 2,42 + 0,29 e 2,77 + 0,50 vs 0,74 + 0,15; respectivamente) e se manteve por 72 horas apenas no grupo EPA + DHA comparado ao controle (4,19 + 1,44 vs 1,09 + 0,18; respectivamente). Não foi observada diferença entre os grupos para os transcritos PTGES (P = 0,7799), PTGES2 (P = 0,8107) e PTGS2 (P = 0,4183). Foi observada uma tendência na abundância de PTGR4 ser maior (P = 0,1565) no grupo AL quando comparado ao EPA + DHA (0,0020  0,0002 vs 0,0008  0,0002; respectivamente). Também foi observada uma tendência na abundância de AKR1B1 ser maior (P = 0,1618) no grupo AO quando comparado ao CLA (0,2625  0,0265 vs 0,1512  0,0314; respectivamente). Com 72 horas de cultivo observou-se uma maior (P = 0,0044) expressão relativa de PTGS2 no grupo AL comparado ao controle (7,4253 ± 0,5671 vs 4,4689 ± 0,4454). Observou-se maior expressão relativa para o IFNT no grupo AL quando comparado ao controle nos tempos de 24 horas (0,1374  0,0090 vs 0,0990  0,0125 respectivamente; P = 0,0216) e 72 horas (0,2336 ± 0,0126 vs 0,1293 ± 0,0103, respectivamente, P = 0,0031). No tempo de 48 horas, a expressão de IFNT foi maior nos grupos AL, AO, EPA + DHA quando comparados ao controle (0,1699 ± 0,0294; 0,2989 ± 0,1391 e 0,2332 ± 0,0438 vs 0,0899 ± 0.0179, respectivamente, P = 0,0103). No Experimento 2, a produção embrionária foi reduzida no grupo EPA + DHA no D7 e D9 (3,98  1,43 vs 14,94  3,13 vs 2,34  1,29 vs 12,86  3,10). Não foi observada diferença entre os grupos para a expressão relativa do PTGES (P = 0,5496) e AKR1B1 (P = 0,1794). A expressão relativa de PTGS2 foi maior (P = 0,0286) no grupo AO comparado ao grupo controle e AL (1,1090 ± 0,0833 vs 0,7109 ± 0,0748 e 0,7068 ± 0,0577; respectivamente) e o grupo CLA não diferiu dos demais grupos. A expressão de IFNT tendeu (P = 0,1148) a ser maior nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,1544 ± 0,0293 e 0,1750 ± 0,0465 vs 0,0344 ± 0,0073 respectivamente). A expressão de DNMT3A tendeu a ser maior (P = 0,0797) nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,0009 ± 0,0001 e 0,0012 ± 0,0005 vs 0,0001 ± 0,00008 respectivamente). No Experimento 1, conclui-se que a suplementação com AL no meio de cultivo das CT-1 aumenta síntese de PGE2 com 24, 48 e 72 horas de cultivo; aumenta síntese de PGF2 com 24 e 72 horas de cultivo e aumenta razão PGE2/PGF2 com 24 e 48 horas e aumenta a abundância relativa dos transcritos PTGS2 com 72 horas de cultivo e de IFNT com 24, 48 e 72 horas de cultivo, podendo ser um grande aliado no RMP. No Experimento 2, conclui-se que a suplementação no meio de cultivo de embriões com AO aumentou a abundância de transcrito para PTGS2 e o CLA e AO tenderam a aumentar os transcritos para IFNT e DNMT3A, enquanto a suplementação com EPA + DHA afetou negativamente as taxas de produção embrionária.