Caracterização cinética da fosfatase alcalina durante o processo de ossificação em Lithobates catesbeianus - Colosio, Rafael Rodrigues (2019)
Os processos de formação, crescimento, remodelação e, quando necessário, reparo do tecido ósseo ocorrem pela ação coordenada e regulada dos eventos químicos e fisiológicos que participam das ossificações intramembranosa e endocondral, sendo assim, o desequilíbrio das biomoléculas envolvidas no processo, pode levar ao desenvolvimento de patologias ósseas. Durante a metamorfose dos anuros, ocorrem acentuadas e perceptíveis alterações morfológicas que possibilitam a transição do animal do ambiente aquático para o terrestre, sendo a remodelação do esqueleto uma das transformações mais notáveis. Dentre as formas de se estudar o mecanismo de calcificação biológica, as enzimas fosfatase alcalina e fosfatase ácida tartarato-resistente são utilizadas por serem consideradas marcadores bioquímicos da ação dos osteoblastos e dos osteoclastos, respectivamente. Neste sentido, foram realizados estudos em girinos e rãs de Lithobates catesbeianus com o objetivo de se compreender melhor tais processos de ossificação. A média da atividade específica para a hidrólise do pNFF (pH=10,5) pela fosfatase alcalina solubilizada por fosfatidilinositol fosfolipase C-específica (PIPLC) de Bacillus cereus, entre as diferentes regiões ósseas nas diferentes idades do animal, foi de 1142,57 U.mg-1, enquanto que para a hidrólise do PPi (pH=8,0) foi de 1433,82 U.mg-1. Dentre os compostos testados sobre a atividade enzimática, aquele que mais influenciou foi o EDTA, com aproximadamente 67% de inibição para a atividade de pNFFase, e 77% para a de PPase. No caso dos parâmetros cinéticos, a enzima apresentou comportamento “Michaeliano” para a hidrólise do pNFF, bem como para o PPi. O valor de Km ficou em torno de 0,6 mM para a atividade de pNFFase e variou de 0,01 a 0,11 para a atividade de PPase, indicando que a enzima possui maior afinidade por este substrato. O estudo da hidrólise do pNFF e do PPi pela enzima revelou que o pH ótimo de atuação para o pNFF foi de 10,5, enquanto o do PPi, o qual é considerado o verdadeiro substrato da fosfatase alcalina, foi de 8,0, próximo ao fisiológico. Os resultados obtidos mostram que independentemente do tipo de ossificação que ocorre, trata-se da mesma enzima ou isoenzimas atuando nas diferentes regiões ósseas e nas diferentes fases de vida dos anuros. Além disso, o início da formação do osso ocorre na diáfise até o final da metamorfose e segue em direção às epífises quando o animal atinge a fase adulta. Tal fato pode ser explicado porque na fase aquática os ossos não necessitam ser tão rígidos quanto na terra, onde o efeito do impacto direto sobre este tecido provoca uma adaptação mecânica devido ao estímulo externo, logo, o animal precisará de membros reforçados para poder se locomover através de saltos. A semelhança dos resultados com trabalhos realizados com outros vertebrados demonstra que os anfíbios podem ser considerados ótimos modelos animais para o estudo da calcificação biológica.