Caracterização da interação entre a proteínas NS5 do vírus da febre amarela e EIF3L - Morais, Ana Theresa Silveira de [UNESP] (2012)
O vírus da Febre Amarela (YFV) pertence ao gênero Flavivirus e causa uma importante doença. Nos últimos anos, uma alarmante ressurgência da circulação viral e expansão do vírus em áreas endêmicas têm sido detectadas na África e América do Sul. NS5 é uma proteína viral não estrutural com duas atividades essenciais para a replicação viral, uma de metiltransferase e outra de RNA Polimerase dependente de RNA (RdRp). Para o melhor entendimento dos mecanismos de replicação viral, interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido amplamente estudadas. Assim, os objetivos desse estudo foram caracterizar a interação da proteína NS5 e eIF3L, avaliar a função de eIF3L na replicação do vírus da febre amarela, e caracterizar estruturalmente a proteína eIF3L. Métodos. Para identificar a interação de NS5 YFV com eIF3L, foi realizado ensaios em sistema duplo-híbrido usando RdRp NS5 YFV contra eIF3L. Para o mapeamento da interação, foram construídos mutantes deletantes de RNApol e analisados em sistema duplo-híbrido. A região de interação de RNApol foi segmentada em três fragmentos e analisada na presença de eIF3L. Para mapear os resíduos de NS5 críticos para a interação, foi realizada mutagênese sítio-dirigida no segmento 3 de ID. A interação foi analisada em ensaios in vitro e em cultura de células de mamíferos. A significância de eIF3L para a replicação do YFV foi investigada usando superexpressão de eIF3L em células BHK21-RepYF17D LucNeoIres. A proteína eIF3L foi purificada usando uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular para subsequente caracterização estrutural. Resultados. Nesse estudo, foi caracterizada a interação de NS5 com o fator eucariótico de início de tradução...