Papel da EPPIN (Epididymal protease inhibitor) sobre a maturação pós-testicular de espermatozoides de camundongos: consequências para a função espermática. - Silva, Alan Andrew S. [UNESP] (2021)
Cerca de 40% das 215 milhões de gestações que ocorrem anualmente no planeta não são planejadas pelos casais, das quais 20% acabam em abortamentos. Este cenário reforça a necessidade do desenvolvimento de novos métodos contraceptivos, em especial os masculinos, cujas opções atuais limitam-se ao preservativo e vasectomia. A EPPIN (Epididymal protease inhibitor) é uma proteína rica em resíduos de cisteína que contém em sua sequência primária os domínios inibidores de protease do tipo WFDC (N-terminal) e Kunitz (C-terminal). A EPPIN é encontrada na superfície do espermatozoide, onde exerce um papel fundamental essencial na função do gameta masculino. A relevância da EPPIN como alvo espermático para contracepção masculina foi demonstrada pelos efeitos inibitórios de anticorpos anti-EPPIN e de ligantes orgânicos de baixo peso molecular sobre a motilidade do espermatozoide humano e de primatas não-humanos. O desenvolvimento de fármacos contraceptivos com alto grau de eficácia e segurança baseados na EPPIN como alvo molecular requer um profundo entendimento de suas funções e mecanismos moleculares pelos quais esta proteína regula a fertilidade masculina. Visando fomentar avanços nesse sentido, investigamos o papel da EPPIN em eventos associados à motilidade e capacitação espermática, bem como impacto da maturação póstesticular sobrea distribuição celular da EPPIN em espermatozoides de camundongos. Para determinar o efeito da maturação e capacitação espermática sobre a localização da EPPIN no espermatozoide murino, realizamos ensaios de Western blot e imunofluorescência. Para investigar o papel da EPPIN no controle da motilidade espermática, avaliamos o efeito de anticorpos anti-EPPIN que reconhecem epítopos nos domínios Kunitz (anticorpo S21C e F21C) e WFDC (anticorpo Q20E) sobre parâmetros de motilidade e cinemática por análise computadorizada (CASA). Detectamos uma dinâmica na presença da EPPIN na fração solúvel em Triton X-100, na fração enriquecida de membrana, e em associação com estruturas do citoesqueleto de espermatozoides epididimários, sugerindo uma associação entre o grau de maturação espermática e a distribuição celular da EPPIN. Observamos que o anticorpo S21C, mas não o F21C, inibiu a motilidade espermática progressiva e hiperativada. Em suporte a estes achados, o anticorpo S21C alterou os parâmetros de cinemática que descrevem a progressividade (VSL, VAP e STR) e o vigor (VCL, ALH e LIN) do movimento espermático. Interessantemente, o fragmento S21C Fab reproduziu efeitos similares ao total, indicando que a ligação monovalente ao epítopo S21C é suficiente para afetar a motilidade e hiperativação espermática. Por sua vez, o anticorpo Q20E (inteiro e fragmento Fab) inibiu a motilidade progressiva e os parâmetros de cinemática (VAP, VCL, ALH) de forma menos intensa em comparação ao anticorpo S21C. Visando investigar o mecanismo de ação associado aos efeitos dos anticorpos anti-EPPIN sobre a motilidade progressiva e hiperativada, avaliamos a fosforilação da proteína quinase A (PKA) e a produção de adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico (AMPc) associados à capacitação por Western blot e AlphaScreen. Nossos resultados demonstraram que o anticorpo S21C induziu aumento na PKA total/PKA fosforilada, sem alterar e os níveis intracelulares de AMPc. Em conclusão, o domínio Kunitz da EPPIN desempenha papel essencial na regulação da motilidade espermática e hiperativação, e seu domínio WFDC pode contribuir para com estes efeitos. A presença da EPPIN em estruturas associadas ao citoesqueleto celular reforça o seu envolvimento em eventos associados à motilidade espermática. Os achados deste estudo contribuem para o desenvolvimento da EPPIN como alvo farmacológico para contracepção masculina.