Abordagens bionalíticas baseadas em peptídeo recombinante selecionado por Phage Display visando a detecção e caracterização de câncer de mama - Alves, Rafael da Fonseca [UNESP] (2023)
O câncer de mama (CM) é o tumor maligno mais comum na população mundial. Assim, métodos mais precisos e que detectem a doença precocemente são necessários, de modo que técnicas inovadoras como o Phage Display (PD) vêm sendo amplamente exploradas. Nesse contexto, a construção de sensores biológicos e imunoensaios do tipo ELISA baseados em peptídeos ligantes selecionados por PD se mostra como uma promissora alternativa no desenvolvimento de novas abordagens bioanalíticas, sendo que estas se destacam pela sensibilidade e seletividade. Esta Tese, portanto, em consonâncias com as atuais demandas da área oncológica, objetivou desenvolver novas metodologias bioanalíticas voltadas para o CM. No Capítulo II, uma nova matriz para o acoplamento de biomoléculas na superfície de eletrodos de grafite de lapiseira (PGEs) foi gerada através da modificação eletroquímica com um novo material derivado do ácido 3-(3-aminofenil)propiônico (3-3-AAFP). Foram realizadas caracterizações eletroquímicas e morfológicas, sendo proposto o mecanismo de eletropolimerização do poli(3-3-AAFP), no qual os grupos carboxilato são mantidos na estrutura do polímero formado. Um novo teste ELISA e um biossensor eletroquímico, foram testados com o soro de pacientes diagnosticados com CM ou doença benigna da mama (DBM), visando detectar antígenos circulantes, ambos utilizando o peptídeo Biotina-H2 ou Biotina-C3. Foram plotadas curvas ROC, sendo para cada resultado significativo e realizados os cálculos da análise de desempenho, para os testes ELISA e o biossenssor, respectivamente. O peptídeo Biotina-H2 apresentou um desempenho inferior (AUC de 0,677 e 0,806) comparado ao peptídeo Biotina-C3 que, além de manter o potencial diagnóstico (AUC de 0,771 e 0,951), caracterizou CM luminal de acordo com o status p53 (AUC de 0,886 e 0,748) e a expressão de HER2 (AUC de 0,748 e 0,833), sendo o biossensor uma melhor estratégia quando comparado ao teste ELISA. Além disso, no Capítulo III, por meio de um estudo proteômico, foram identificados 38 possíveis alvos para o peptídeo Biotina-C3, sendo estes presentes em membrana plasmática e membranas de organelas celulares, principalmente de mitocôndrias. Visando a detecção e caracterização de exossomos derivados de linhagens celulares de CM, ensaios de citometria de fluxo foram conduzidos. Para isso, exossomos imobilizados diretamente em partículas magnéticas e indiretamente em partículas magnéticas modificadas com anticorpos anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81 foram utilizados para validar a capacidade do peptídeo Biotina-C3 de se ligar aos exossomos. Estes também foram detectados por magneto-ELISA e por biossensor eletroquímico magnético, com LODs menores para a linhagem MCF-7, sendo (LOD magneto-ELISA de 330 exossomos μL−1) e (LOD Biossensor de 175 exossomos μL−1) em comparação com as outras linhagens celulares. A detecção de exossomos derivados da linhagem Luminal (MCF-7), em soro humano foi realizada com sucesso, e a combinação de partículas magnéticas modificadas com anti-CD63, seguida da detecção baseada no peptídeo Biotina-C3 proporcionou resultados promissores em termos de especificidade e recuperação, para o teste ELISA (108,8%) e para o Biossensor (111,9%). Estas novas abordagens bionalíticas permitirão o desenvolvimento de novas plataformas rápidas e inovadoras para a caracterização do CM e seus subtipos moleculares.