Identificação do secretoma lignolítico de Neurospora crassa envolvido na desconstrução da parede celular vegetal - Silva, Maria Carolina da (2019)
A celulose é uma importante fração da biomassa vegetal e seu acesso é prejudicado pela lignina. Atualmente os métodos empregados para remover a lignina incluem pré-tratamentos físico-químicos severos, que aumentam o custo de produção dos compostos relacionados à lignina e causam impacto ambiental. A substituição destes métodos por coquetéis enzimáticos é uma alternativa para a remoção da lignina sem prejudicar o meio ambiente. Os fungos filamentosos são excelentes produtores de enzimas lignocelulolíticas. Embora Neurospora crassa não seja considerada industrialmente um bom organismo produtor de enzimas, estudos demonstram que este fungo degrada biomassa vegetal de maneira bastante eficiente, fato que pode ser explicado em parte, pela presença de pelo menos vinte genes codificando proteínas com atividade lignolítica em seu genoma. Este trabalho teve objetivo decifrar o secretoma de N. crassa na presença de lignina, bagaço de cana-de-açúcar e serragem, para identificar/descobrir proteínas com atividades lignolíticas que possam ser incorporadas em coquetéis enzimáticos com diferentes finalidades comerciais. Inicialmente, foi analisado o crescimento radial de N. crassa WT em meio VM sólido, contendo 10% de cana ou serragem (pré-tratados ou não com calor e/ou ácido) ou lignina (0,5 a 10%) como fontes de carbono alternativas, utilizando como controle 2% sacarose. Os micélios obtidos em lignina desenvolveram mais lentamente foram bem menores que para as outras fontes de carbono, mostrando que a lignina sozinha é prejudicial para o crescimento do fungo. A concentração inibitória mínima de lignina para o crescimento do fungo foi determinada em race tubes e estabelecida em 0,5%. N. crassa WT foi então cultivada em meio VM líquido na presença das diferentes fontes de carbono e as proteínas secretadas foram analisadas por SDS-PAGE. Bandas proteicas de diferentes MM foram detectadas em todos os tempos e condições avaliadas para todas as amostras, estando presentes em maior número na cana. A atividade lacase foi determinada pela oxidação da siringaldazina nos secretomas de cana e serragem. Para as amostras de cana, a maior atividade enzimática foi detectada após 96h de cultivo. Para as amostras de serragem, a maior atividade enzimática foi detectada após 7 dias de cultivo apenas na amostra tratada com calor/ácido. Para a lignina, não foi possível ensaiar atividade enzimática pela limitação do método colorimétrico. Os secretomas do fungo foram determinados por nanoLC-MS/MS, em amostras proteicas coletadas após 20h e 96h de cultivo na presença de 0,5% de lignina ou após 96h de cultivo em 10% de bagaço tratado com calor/ácido. Para as amostras de lignina de 20h e 96h foram identificadas, respectivamente, 77 e 113 ORFs, destacando-se várias ORFs anotadas como hipotéticas e enzimas envolvidas na degradação de hemicelulose, sugerindo que para modificar a lignina, os fungos precisam inicialmente perceber a biomassa vegetal. Para a cana, foram identificadas 412 ORFs, estando várias delas ainda anotadas como hipotéticas, ou codificando proteínas com atividades celulolíticas, hemiceluloliticas e oxidases. A amostra de serragem cultivada por 7 dias tratada com calor/ácido está tripsinizada e deverá ser submetida a nanoLC-MS/MS. Os resultados dos secretomas serão validados por qPCR e as ORFs hipotéticas ou consideradas potenciais alvos biotecnológicos deverão constituir novos objetos de estudos.