Estabelecimento de um modelo tridimensional para determinação da eficácia e segurança farmacológica de derivados de nitrofuranos e indólicos e avaliação da infecção de Histoplasma capsulatum - Vaso, Carolina Orlando [UNESP] (2022)
As culturas tridimensionais (3D) são um tipo de cultivo celular que têm o propósito de simular mais fidedignamente o tecido in vivo. As doenças fúngicas afetam mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo. A crescente evolução da resistência microbiana e os efeitos adversos dos antifúngicos atuais auxiliam no surgimento de novos medicamentos. Esse estudo teve o objetivo de estabelecer esferoides de células pulmonares para avaliar a toxicidade de derivados de nitrofuranos e indólicos e explorar a interação H. capsulatum-hospedeiro. Além disso, objetivou-se estudar a toxicidade desses compostos in vivo utilizando animais alternativos, bem como averiguar o(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação. Esferoides das linhagens pulmonares A549 e MRC-5 foram caracterizados pelo método de azul de Trypan, resazurina e iodeto de propídeo. O tamanho, a forma e densidade celular foram avaliados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e confocal. Testes de sensibilidade foram conduzidos de acordo com o documento M27-A3, proposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), com pequenas modificações nos ensaios com H. capsulatum. A citotoxicidade foi avaliada em esferoides e em monocamada, por meio da adição de resazurina. A toxicidade in vivo foi avaliada no modelo de Caenorhabditis elegans, Galleria mellonella e Zebrafish. Foi verificada ação antibiofilme dos compostos mais potentes para H. capsulatum, pelo método de redução do sal tetrazólico (XTT). Os danos nos biofilmes maduros, foram visualizados por MEV e confocal. O mecanismo de ação foi averiguado pela quantificação do ergosterol da membrana, verificação de danos de parede com Calcofluor White, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) utilizando 2,7-dichlorodihydrofluoresceina, morte celular pelo ensaio de iodeto de propídeo (IP)/Anexina e técnica de PCR em tempo real. As interações entre células planctônicas e de biofilme maduro de H. capsulatum foram realizadas nos esferoides e comparadas às infecções nas mesmas condições em monocamadas, por PCR em tempo real. Os esferoides apresentaram diâmetros entre 370-600 μm e viabilidade maior que 80% após 10 dias de formação. A MEV e confocal mostraram uma arquitetura esferoidal íntegra e constituída por células interconectadas entre si. Dos compostos testados contra H. capsulatum, 18 foram mais eficazes com valores de CIM90 de 0,122 a 61,25 μg/mL. No geral, os compostos testados foram menos tóxicos nos esferoides comparativamente à monocamada. Dentre os compostos testados o L7CF 166 (derivado de nitrofurano), o L7CF 197 (derivado indólico) e L7CF 219 (derivado nitrofurano/indólico) foram os mais específicos para o H. capsulatum. Nos modelos alternativos C. elegans, G. mellonella e zebrafish a toxicidade dos compostos foi baixa, mesmo em concentrações elevadas. Os compostos inibiram o biofilme inicial e maduro na concentração igual ou duas vezes a requerida para as células planctônicas. As micrografias mostraram uma redução na atividade metabólica, na espessura e na matriz extracelular dos biofilmes. Os três compostos reduziram a quantidade do ergosterol presente na membrana fúngica. Dois compostos L7CF 166 e L7CF 219 foram capazes de causar deformações na parede celular. Já os L7CF 197 e L7CF 219 foram capazes de induzir EROs nas células. Além disso, os três compostos provocaram morte celular por via necrótica. Os esferoides infectados com a forma planctônica obtiveram uma modulação negativa para o gene CBP1. Já os esferoides infectados com biofilme, apresentaram modulação positiva para o gene CBP1 e a GAPDH e, modulação negativa para gene DDR8. Adicionalmente, foram testados a série de derivados de nitrofuranos contra diferentes espécies de fungos. A citotoxicidade foi avaliada utilizando os cultivos em monocamada e esferoides de A549 e MRC-5 e toxicidade in vivo no modelo alternativo de C.elegans. A maioria dos compostos apresentou baixa atividade inibitória. Os valores mais potentes de CIM90 foram de 0,48 μg/mL contra Paracoccidioides brasiliensis (L7CF 182), 0,98 μg/mL contra Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (L7CF 193) e 3,9 μg/mL contra cepas de Candida e Cryptococcus neoformans (L7CF 113 e L7CF 181, respectivamente). Além disso, todos os compostos apresentaram baixa toxicidade quando testados in vitro e in vivo. Baseado nesses resultados, os esferoides mostram-se viáveis para o estudo de toxicidade de fármacos e para experimentos de infeção. No geral, os resultados sugerem que derivados de nitrofuranos e indólicos são compostos promissores para o tratamento de infecções fúngicas.