Produção de anticorpos monoclonais para imunodiagnóstico de paracoccidioidomicose causada por Paracoccidioides lutzii - Neves, Franciny Mara de Lima [UNESP] (2020)
Doenças relacionadas ao reino Fungi vem aumentando consideravelmente devido as alterações do sistema imunológico, resultando em 1,5 a 2 milhões de mortes por ano. Uma destas é a paracoccidioidomicose (PCM) - uma micose sistêmica, endêmica da América Latina causada por P. brasiliensis e espécies relacionadas como o P. lutzii. Com a descoberta de novas espécies de Paracoccidioides spp e sua alta variabilidade antigênica, seu diagnóstico pode ter um número substancial de resultados falsos negativos. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas capazes de reconhecer antígenos diferencialmente expressos é de suma importância. Com a finalidade de melhorar parâmetros sorológicos para o diagnóstico de PCM causado por P. lutzii, este estudo apresenta uma estratégia inovadora de imunização, que visa a obtenção de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer epítopos antigênicos específicos. Para isto, foi utilizada a técnica de imunização subtrativa de múltiplas tolerizações, utilizando como tolerógeno antígenos livres da parede do fungo (CFA) derivado de P. brasiliensis e como imunógeno o CFA derivado de P. lutzii. A ciclofosfamida foi empregada durante as etapas de tolerização, a fim de depletar linfócitos T e B responsivos a epítopos antigênicos de P. brasiliensis, aumentando o direcionamento da resposta imune a epítopos determinantes de P. lutzii. A obtenção do CFA de ambas as espécies de Paracoccidioides foi conduzida com sucesso e através dos ensaios de eletroforese e western blotting, pode-se constatar que o material antigênico de P. brasiliensis e P. lutzii possui um vasto repertório de conteúdo proteico, otimizando seu emprego para a obtenção de anticorpos monoclonais voltados a novos biomarcadores da doença. Durante a execução do protocolo subtrativo, a dose do fármaco empregada (200 mg/kg) foi altamente tóxica para os camundongos, culminando com a mortalidade de 100% destes antes do término da etapa de tolerização. Dessa maneira, um segundo protocolo de imunização foi realizado, utilizando uma dose menor (150 mg/kg) que demonstrou diminuição dos efeitos colaterais, prologando a sobrevida desses, embora tenha sido ineficiente em mantê-los vivos até o final do protocolo. Assim, padronizou-se o protocolo com doses de 100 mg/kg, o qual garantiu a sobrevivência dos animais, enquanto apresentou resultados satisfatórios quanto a imunossupressão dos mesmos. A reatividade do soro policlonal dos camundongos submetidos a imunização demonstrou baixa reatividade pelo tolerógeno, predizendo que múltiplos ciclos de tolerização culminam com a depleção de linfócitos T e B reativos a antígenos não desejados, como era esperado. Os hibridomas gerados na fusão celular apresentaram resultados promissores em seus screenings para 32 diferentes hibridomas policlonais, dos quais três foram selecionados para clonagem devido a sua alta reatividade aos antígenos de P. lutzii quando comparada aos antígenos de P. brasiliensis. Da clonagem, foi obtido um clone único com reatividade não exclusiva a P. lutzii, mas, ainda assim, com potencial uso no diagnóstico da doença.