Caracterização do biofilme de Histoplasma capsulatum em diferentes condições de crescimento in vitro e identificação de proteínas na interação desses biofilmes com macrófagos alveolares murinos - Gonçalves, Larissa Naiara Carvalho [UNESP] (2021)
A histoplasmose é uma micose sistêmica, causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. Biofilmes são comunidades sésseis de microrganismos, que se agrupam de maneira organizada a um substrato ou que se aderem uns aos outros, e estão envolvidos por uma matriz extracelular que eles mesmos produzem. A capacidade desses fungos em formar biofilmes, um fenótipo que pode induzir resistência e aumentar a virulência, foi descrita. Além disso, também foi estabelecida uma correlação entre o modo de infecção de H. capsulatum e a formação dessas comunidades. O presente estudo teve como objetivo aprofundar o estudo dos biofilmes formados por diferentes cepas de H. capsulatum (EH-315, G186A e G217B), por meio da verificação da influência de quatro meios de cultura (BHI, HAM-F12, DMEM e RPMI) e diferentes atmosferas de oxigênio (microaerofilia e aerobiose) no desenvolvimento dessas comunidades. Adicionalmente, também objetivou-se estudar a interação entre células planctônicas e derivadas de biofilme após a infecção em macrófagos alveolares, verificando seu comportamento e sua capacidade de infecção, bem como averiguar a formação de biofilme em ambiente ácido, mimetizando o ambiente intracelular no macrófago e realizando uma análise proteômica por técnica de shotgun, a fim de identificar proteínas exclusivas nessas condições para a futura busca de alvos antifúngicos. A padronização do crescimento fúngico foi conduzida a partir da construção de curvas de crescimento, por meio de contagem de colônias, verificação da viabilidade celular com azul de Tripan e densidade óptica. A formação dos biofilmes foi caracterizada utilizando técnicas de microscopia óptica, e colorimétricas, como o ensaio de redução de XTT, coloração por cristal violeta e safranina, além de microscopia eletrônica de varredura (MEV) para observação das topografias. A interação com os macrófagos alveolares foi observada por microscopia de fluorescência e confocal para posterior análise proteômica em espectrômetro de massas. Nos ensaios de caracterização dos biofilmes, verificou-se que, embora todos os meios de cultura tenham estimulado a maturação das comunidades, o HAM-F12 proporcionou o melhor desenvolvimento de biomassa e material polissacarídico. Em relação às atmosferas de O2, ambas estimularam um excelente desenvolvimento das comunidades, porém, em condições de baixo O2, foi observada uma quantidade exuberante de matriz extracelular quando comparada aos biofilmes formados em aerobiose, principalmente no meio HAM-F12. Nos biofilmes formados em BHI, RPMI e DMEM observou-se uma reversão significativa do fenótipo de levedura para hifa, exigindo uma investigação mais aprofundada. Na interação com macrófagos, observou-se a formação de aglomerados fúngicos em macrófagos. No entanto, a formação dos aglomerados, bem como a fluorescência da marcação com o anticorpo anti-Hsp60 e o sofrimento celular foram mais expressivos na infecção com as células derivadas de biofilme. Além disso, as células derivadas de biofilme exibiram maior taxa de infecção após 1, 5 e 24 horas comparada as células planctônicas. O ambiente ácido não foi impeditivo para a formação de biofilmes maduros. Nos ensaios de proteômica, observou-se diferentes perfis proteicos nas condições testadas, com 72 proteínas exclusivamente expressas pelo biofilme quando comparado ao crescimento planctônico. A grande maioria dessas proteínas é relacionada a funções citoplasmáticas. Os dados proteômicos das células derivadas de biofilme também revelaram um aumento de proteínas envolvidas no estresse, defesa, virulência e na obtenção de energia e uma redução de proteínas envolvidas na síntese proteica e no processo metabólico. No proteoma da infecção pelas células derivadas do biofilme foram identificadas 6 proteínas exclusivas comparada ao controle (biofilme), a maioria classificadas como nucleares, permitindo um entendimento parcial sobre as vias associadas à sobrevivência e adaptação do fungo ao ambiente do hospedeiro. Esses resultados apresentam avanços no campo dos biofilmes e contribuem para estudos futuros que podem provar o papel dessas comunidades na interação patógeno-hospedeiro. Além disso, abrem novas possibilidades para o estudo de alvos com o intuito de estabelecer novas estratégias terapêuticas para histoplasmose.