Caracterização dos biofilmes de dermatófitos e desenvolvimento de protótipos anti-dermatófitos nas formas planctônica e biofilme - Costa-Orlandi, Caroline Barcelos [UNESP] (2016)
Dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir os tecidos queratinizados do homem e dos animais, produzindo a dermatofitose. Biofilmes são comunidades estruturadas de microrganismos que se agrupam de maneira organizada a uma superfície ou que se aderem uns aos outros, dentro de uma matriz extracelular que eles mesmos produzem. Pela primeira vez, neste trabalho, foi descrita a formação de biofilmes por isolados clínicos e cepas ATCC de dermatófitos. Também se avaliou a sensibilidade das cepas frente aos antifúngicos convencionais e derivados sintéticos do ácido protocatecuico, determinando sua toxicidade e eficiência, tanto nas formas planctônicas como de biofilme. A identificação molecular dos isolados clínicos mostrou concordância com a identificação convencional. Todas as cepas e isolados foram capazes de formar biofilmes nos quatro meios testados. Trichophyton. rubrum ATCC 28189, ATCC MYA-4438, T. rubrum 143 e Trichophyton. mentagrophytes 66 produziram mais biomassa e matriz extracelular que T. mentagrophytes ATCC 11481 (p<0.05). RPMI 1640, BHI e DMEM estimularam maior produção de biomassa e matriz extracelular que o meio de queratinócitos. Todas as espécies foram capazes de formar biofilmes maduros em 72 h e uma rede de hifas circundadas em vários pontos por uma matriz extracelular foi mostrada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Na microscopia confocal, aparentemente os meios RPMI e DMEM produziram biofilmes mais espessos e o meio BHI, biofilmes mais densos e compactos. As melhores atividades anti-dermatófitos foram expressas pelos protocatecuatos de butila, pentila, hexila, nonila e decila, que exibiram baixa toxicidade para as células HaCat, NHOK e HepG2 nas regiões da concentração inibitória mínima (CIM). Nonila foi o composto com melhor índice de seletividade para as células HaCat e HepG2; para as células NHOK os compostos mais seletivos foram hexila e nonila. Fluconazol, griseofulvina, terbinafina e nonila inibiram o crescimento das células planctônicas para todas as cepas. No entanto, os biofilmes pré-formados foram resistentes a todos os fármacos, com exceção do composto nonila. As células em formato biofilme foram mais resistentes aos antifúngicos que as células planctônicas. A maioria dos biofilmes tratados teve redução da espessura quando comparada ao não tratado. Nenhum biofilme tratado apresentou 100% de morte celular. Na sequência deste estudo, foi verificado o potencial antifúngico in vitro de nanopartículas de óxido nítrico (NO-np) e de efinaconazol a 10% (Jublia®) contra as formas planctônicas e biofilmes de T. rubrum (cepa MYA-4438 ATCC e um isolado clínico). As NO-np foram capazes de inibir in vitro, o crescimento de T. rubrum. O efinaconazol foi o fármaco que melhor inibiu o crescimento de T. rubrum, seguido pela terbinafina e o fluconazol. As combinações, entre as NO-np, o efinaconazol e a terbinafina produziram interações sinérgicas. A combinação entre as NO-np e o efinaconazol teve um comportamento fungistático na cepa ATCC de T. rubrum. As NO-np não apresentaram toxicidade para as células HaCat. Todos os fármacos testados foram capazes de inibir o crescimento das células planctônicas de T. rubrum; já as NOnp não foram capazes de inibir o crescimento e reduzir a atividade metabólica. Os biofilmes pré-formados foram resistentes a todos os fármacos testados, porém, o biofilme formado pelo isolado clínico de T. rubrum foram sensíveis às NO-np na concentração de 40 mg/mL. Já os biofilmes da cepa ATCC foram resistentes à mesma concentração de nanopartículas. A grande maioria dos resultados da MEV dos biofilmes tratados foi concordante aos resultados mostrados pelo ensaio de redução do XTT. Os tratamentos com o efinaconazol e as NO-np causaram diminuição das espessuras dos biofilmes formados pelo isolado clínico e pela cepa ATCC. Esses resultados representam um avanço para a pesquisa no campo dos dermatófitos e de biofilmes e podem contribuir de maneira significativa para a pesquisa de novos fármacos para o tratamento dessas micoses.