Purificação, caracterização, cristalização e modelagem molecular teórica da fração giroxina do veneno de Crotalus durissus terrificus (Laurenti 1768) - Buchi, Alisson Teixeira [UNESP] (2010)
As serpentes do gênero Crotalus durissus terrificus possuem em seu veneno diversas substâncias, entre elas uma serinoprotease com atividade trombina símile denominada giroxina, a qual é capaz de coagular o fibrinogênio plasmástico, promovendo a formação de fibrina. O objetivo do estudo foi a purificação e caracterização estrutural da enzima giroxina de Crotalus durissus terrificus. Para tanto, foram utilizadas métodos cromatográficos de gel filtração em Sephadex G75 e afinidade em Benzamidina-Sepharose 6B para isolamento e purificação; eletroforéticos de SDSPAGE 12% reduzido e de seqüenciamento do N-terminal da enzima purificada para identificação e avaliação do grau de pureza; clonagem e expressão do cDNA da glândula venenífera por RT-PCR e testes de cristalização. A modelagem teórica molecular foi realizada a partir de ferramentas de bioinformática baseadas em análises comparativas de outras serinoproteases depositadas no NCBI (National Center for Biotechnology Information). O seqüenciamento N-terminal da giroxina purificada, produziu uma proteína de cadeia única com massa molecular aproximada de 30 KDa e sua seqüência completa de cDNA apresentou 714 pb os quais codificaram uma proteína completa contendo 238 aminoácidos. Foram obtidos cristais a partir das soluções nos 2 e 5 do Kit Crystal Screen® 2 e 1 respectivamente, verificando-se sua constituição protéica. Para os alinhamentos múltiplos da sequência molde giroxina símile B2.1 com outras seis serinoproteases derivadas de veneno de serpentes (SVSPs) indicou-se a preservação de resíduos de cisteína e de seus principais elementos de estruturais (α-hélices, β-barris e loops).Evidenciou-se a localização da tríade catalítica nos aminoácidos His57, Asp102, Ser198 e os sítios de atividade especifica S1 e S2 nos aminoácidos Thr193 e Gli215 respectivamente...