Investigação da resposta inflamatória disparada pela proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus da Zika (ZIKV) e da Dengue (DENV) em modelos experimentais de epididimite murina - Camargo, Isabela Andrade de [UNESP] (2024)
Os Arbovírus formam um grupo de vírus taxonomicamente diverso. Do ponto de vista epidemiológico e clínico, o vírus da dengue (DENV), o Zika (ZIKV) e o Chikungunya (CHKV), transmitidos pelo mosquito Aedes spp., são considerados os arbovírus de maior relevância, pois estima-se que cerca de 3,9 bilhões de pessoas, vivendo em 120 países, estão susceptíveis a infecções por pelo menos um deles. O DENV e ZIKV codificam a proteína não estrutural 1 (NS1), que possui papel fundamental nas manifestações clinicas dessas infecções virais, além de ser um potencial marcador para o diagnóstico de infecção aguda precoce. Estudos em células endoteliais e macrófagos em cultura demonstraram que a NS1 da DENV atua como agonista do receptor Toll-like 4 (TLR4), induzindo a secreção de citocinas, o que contribui para a gravidade da dengue. Nesse contexto, sabe-se que infecções virais podem causar inflamações no epidídimo, um órgão do sistema reprodutor masculino fundamental para a maturação dos espermatozoides e fertilidade masculina. Estudos utilizando o modelo experimental de epididimite murino demonstraram que o ZIKV coloniza e se multiplica no epidídimo, causando um quadro inflamatório conhecido como epididimite. Entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da infecção por DENV no sistema reprodutor masculino. No presente estudo investigamos se as isoformas de NS1-ZIKV e NS1-DENV desencadeiam resposta inflamatória no epidídimo de camundongos, e se essa resposta é mediada pela ativação do TLR4. Utilizamos o modelo experimental de epididimite ex vivo, no qual as regiões proximal (segmento inicial) e distal (cauda do epidídimo) de camundongos C57BL/6 machos (90-120 dias) foram isoladas e incubadas por 3 h (34°C e 5%/95% de CO2/ar) com salina estéril (controle negativo), LPS ultrapuro de E. coli (50 ng/ml, controle positivo), NS1-DENV e NS1-ZIKV [1, 10 e 20 μg/ml]. Após as incubações, os tecidos e meio de cultura organotípica foram coletados e processados para ensaios de RT-qPCR e Multiplex, para avaliação da expressão de mediadores inflamatórios (Il6, Il1b, Tnf, Il10, Ccl2, Ccl3, Ccl4, Ccl5, Cxcl2 e Cx3cl1), elementos da via de sinalização TLR (Tlr4, Cd14, Myd88, Trif e Tlr3), enzimas envolvidas na resposta inflamatória (Ptgs1, Ptgs2 e Ido1) e genes envolvidos na função do epidídimo (Gja1, Cdh1, Cldn1, Cldn3 e Cldn8). O desafio inflamatório mediado por NS1-ZIKV e NS1-DENV regulou positivamente a expressão relativa de transcritos que codificam citocinas pró e anti-inflamatórias (Il1b, Il10, Ifnb1 e Ifng), quimiocinas (Ccl3, Ccl4, Ccl5 e Cxcl2), enzimas e adesão celular (Ptgs2, Icam1 e Vcam1) no segmento inicial e na cauda do epidídimo. A pré-incubação do segmento inicial e cauda do epidídimo com CLI-095 (3 μM), um inibidor da via TLR4, demonstrou que as regiões proximais e distais do epidídimo respondem diferencialmente à inflamação induzida pelas isoformas de NS1 dos flavivírus ZIKV e DENV, sendo parcialmente dependente da via TLR4 na cauda do epidídimo. Ambas as proteínas NS1 promovem regulação da expressão de genes envolvidos na inflamação aguda do epidídimo, sendo possivelmente essenciais para o reconhecimento do ZIKV e DENV pelo epidídimo. Afim de determinar se a infecção por DENV induz resposta inflamatória no epidídimo, investigamos se a infecção com DENV-2 cepa NGC por via intracerebral em camundongos machos Balb/c (8 semanas, dose referente a carga viral de 40 x LD50) ou meio 199 (controle negativo) induz expressão de mediadores inflamatórios. Os animais foram eutanasiados após 4, 5 e 7 dias da infeção, seus epidídimos coletados, segmentados em 4 diferentes regiões (segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo) e processados para ensaios de RT-qPCR. Os resultados demonstraram aumento dos níveis de citocinas (Tnf) e interferons (Infg e Infb1) nas diferentes regiões do epidídimo de camundongos. Portanto, o desafio de infecção de DENV-2 intracerebral, demonstrou que o vírus DENV é capaz de mediar a regulação gênica e no aumento das moléculas envolvidas na inflamação aguda do epidídimo. Em conclusão, nossos resultados demonstram que a NS1 atua como um padrão molecular associado à infecção por ZIKV e DENV no epidídimo, participando da resposta do órgão contra essas infecções virais. O presente estudo amplia o entendimento da fisiopatologia epididimite viral e suas implicações na fertilidade.