Perfilagem fosfoproteômica das glândulas produtoras de seda da aranha Trichonephila clavipes - De-Souza, Caroline Lacerra (2021)
Apesar do grande interesse pelas propriedades mecânico-elásticas das fibras da seda produzida pelas aranhas, visando o seu uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas devido as suas propriedades de resistência, elasticidade e biocompatibilidade, pouco se conhece sobre os detalhes das glândulas produtoras de seda e o processo de fiação que ocorre para a produção das fibras. Dessa forma, alguns estudos têm demonstrado que as glândulas produtoras de seda apresentam diversas proteínas relacionadas com o envolvimento na secreção das proteínas da seda, transporte, regulação de atividades proteolíticas e preservação das proteínas da seda contra o estresse oxidativo e degradação, durante todo o processo de fiação; além disso, estudos também já demonstraram nas fibras de seda da teia, a presença de toxinas de ação geral e de neurotoxinas, comuns em venenos animais, sugerindo que essas toxinas/neurotoxinas contribuem para a paralisia e captura de presas. Porém, esses estudos não têm considerado a possível presença de modificações pós-traducionais (PTMs) que podem atuar sobre a atividade biológica e função dessas moléculas. A determinação de PTMs é fundamental para a elucidação de processos que controlam os eventos celulares, como crescimento, divisão e diferenciação celular, incluindo a interação entre proteínas. Portanto, no presente estudo adotamos o uso da cromatografia de afinidade com TiO2 como método de enriquecimento de fosforilação, combinados com a abordagem proteômica livre de gel - shotgun, utilizando ténicas avançadas de espectrometria de massas in tandem (µLC-ESI-micrOTOF-Q-III-CID) a fim de identificar o perfil fosfoproteômico das glândulas que secretam a seda da aranha Trichonephila clavipes. Os resultados obtidos com a análise fosfoproteômica do conjunto de glândulas produtoras de seda da ranha T. clavipes, mostrou a identificação de 1316 proteínas fosforiladas sendo que 155 foram identificadas na glândula agregada, 580 na ampulada maior, 143 na flageliforme e 438 na ampulada menor. Estas fosfoproteínas foram classificadas de acordo com a sua função geral e subdividas em sete diferentes grupos de proteínas: (i) proteínas estruturais que compõem as fibras da seda – as espidroínas; ii) proteínas relacionadas com o transporte de íons e oxigênio nas glândulas para manter a estabilidade das espidroína; (iii) proteínas relacionadas com o dobramento/conformação e modificação das espidroínas; (iv) proteínas relacionadas com a preservação das espidroínas contra o estresse oxidativo; (v) proteínas relacionadas com a preservação das características fibrilares das espidroínas no meio ambiente; (vi) proteínas housekeeping e (vii) proteínas relacionadas com a captura e pré-digestão de presas. Para o último grupo, foram identificadas 284 proteínas semelhantes a toxinas, neurotoxinas, enzimas proteolíticas, e defensinas em sua forma fosforilada. O enriquecimento funcional destas proteínas nos permitiu avaliar a contribuição de suas funções às caracteríticas fisico-químicas das proteínas estruturais da seda, bem como a interação entre os grupos funcionais das proteínas listadas envolvidas com o processo de fiação da seda; assim como também a influência sobre a atividade tóxica das toxinas. Os resultados também permitiram identificar uma série de sequências peptídicas fosforiladas que não apresentaram resultados de Identificação com proteínas depositadas nos bancos de dado e foram obtidas utilizando da abordagem de sequenciamento de novo e submetidas a um alinhamento de sequencias utilizando a ferramenta BLASTP. O ensaio de inseto-toxicidade realizado ao final do estudo, nos permitiu verificar a toxicidade do extrato bruto fosforilado das glândulas ampulada maior e agregada, que apresentaram os valores de dose letal, DL50=28,40 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula ampulada maior e DL50=23,07 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula agregada. Dessa forma, demonstramos que a combinação do uso de métodos baseados em cromatografia de afinidade, como a estratégia de enriquecimento de proteínas/peptídeos fosforilados, e o uso de uma abordagem proteômica com estudos de PTMs se mostrou uma estratégia eficiente na investigação de amostras complexas, como as glândulas produtoras de seda da teia de aranhas. Um estudo com modificações pós-traducionais das proteínas presentes nas glândulas produtoras de seda da aranha T. clavipes, como demonstrado no presente trabalho, nos possibilitou obtermos informações biológicas e químicas das características dessas moléculas, contribuindo para uma melhor compreensão sobre o perfil fosfoproteômico das glândulas analisadas.