Glicerol-3-Fosfato oxidase em levedura de panificação - Camargo, Luciana Amade [UNESP] (2007)
A presente dissertação permitiu quantificar a presença de glicerol-3-fosfato oxidase (GPO, sn-glicerol-3-fosfato: oxigênio 2-oxidorredutase, EC 1.1.3.21) em extratos de levedura seca de panificação por dois métodos: polarográfico e colorimétrico. A melhor metodologia de purificação da GPO foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, em homogenizador do tipo Bead Beater (Biospec products, USA), por 15 minutos, com 27,6% de eficiência de lise celular. O extrato celular bruto foi tratado com 1% de sulfato de estreptomicina antes da precipitação com igual volume de solução 30% (p/v) de polietilenoglicol 3350, dialisado e a sua atividade otimizada por método colorimétrico. A determinação das características da GPO foi possível em ensaios contendo: 250 mM de glicerol-3-fosfato em tampão 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 contendo 0,1% Triton X-100; 0,0133% de 4-aminoantipirina; 0,0266% de fenol; cerca de 0,40 unidade de peroxidase (PO) e água destilada para completar o volume de ensaio. A reação foi iniciada pela adição de 15 æL de extrato enzimático diluído 10 vezes seguido de uma incubação de 2 horas a 60°C e interrompida pela adição de solução 10% de SDS e a coloração desenvolvida foi medida a 500 nm. A GPO apresentou alta estabilidade térmica, pH de estabilidade entre 7,0 - 8,0 e a presença de azida de sódio na concentração de 0,05% manteve a atividade da enzima por 21 dias a 40°C. Este método permitiu também quantificar glicerol-3- fosfato, importante metabólito intermediário da biossíntese lipídica e glicolítica, na faixa de 56 - 250 mM.