Estudo visando a produção de uma cápsula para transplantação fecal: da seleção de doadores de fezes aos ensaios laboratoriais - Missio, Aline Parisoto [UNESP] (2022)
Inúmeros estudos apontam a importância da microbiota intestinal na manutenção da homeostase do organismo, de modo que alterações em sua composição de espécies podem estar associadas a causa de várias doenças. Em muitos casos, estas alterações - conhecidas como disbiose - podem ser revertidas pela administração de probióticos, que são microrganismos com algum papel modulador, com efeitos benéficos para além do intestino. Uma estratégia de restauração da normobiose intestinal é a aplicação direta de fezes de indivíduos saudáveis naqueles apresentando algum tipo de patologia associada com disbiose. Esta abordagem, que tem surtido efeito em muitos ensaios clínicos, sendo até mesmo recomendada para doenças como a diarreia por Clostridioides difficile refratária à antibioticoterapia, apresenta uma série de desafios, tendo em vista a necessidade de se evitar a transmissão de patógenos intestinais (segurança) e de garantia (eficácia) de restauração da normobiose. Este trabalho teve como propósito explorar pontos que assegurem o alcance destes objetivos, aplicando-os ao formato de transplantação fecal menos invasivo - a cápsula. A primeira etapa do trabalho consistiu na seleção de doadores de fezes, iniciando-se com uma chamada pública que teve alcance nacional, seguida de um processo de seleção, compreendendo uma triagem por entrevista, exames clínicos e laboratoriais para atestar a saúde e ausência de patógenos nas fezes de potenciais candidatos. Após ou em paralelo a esta fase de avaliação do nível de segurança das fezes de interessados em participar do processo de seleção, foi feita a análise do microbioma fecal, para eventualmente atestar sua eficácia. Além de atestar a segurança do candidato para ser um doador, excluindo, por exemplo, aqueles apresentando doenças crônicas, a entrevista permitiu coletar informações que poderiam dificultar ou comprometer a colheita e manutenção da viabilidade microbiana nas fezes. As questões foram divididas em duas categorias: aquelas visando a obtenção de informações de natureza transitória ou aquelas que poderiam comprometer definitivamente a participação do interessado. De um total de 221 candidatos, 196 foram eliminados por apresentarem limitações tais como, diagnóstico de doenças crônicas ou residirem em local impeditivo de realização de colheita (fora da cidade de Botucatu). Aos 25 candidatos que passaram na triagem da entrevista, foi solicitado o encaminhamento para os exames laboratoriais preliminares. Destes, 11 desistiram do processo de seleção e 6 foram desqualificados, por terem se mudado de Botucatu. Os oito remanescentes incluíram 2 que vieram a se mudar de Botucatu, nesta etapa, 1 que teve restrição nos exames laboratoriais, 1 que passou a apresentar constipação intestinal crônica e 1 que iniciou um regime terapêutico com possível implicação no equilíbrio na microbiota. De modo que restaram apenas 3 indivíduos elegíveis e que forneceram amostras fecais para análise de microbioma, que também foram utilizadas para a avaliação de protocolos de produção de cápsulas de administração oral. Foram coletadas 3 amostras, de cada um destes indivíduos, em dias diferentes, que serviram para a comparar a diferença na riqueza e abundância de OTUs (Operational Taxonomic Units) do microbioma deles, bem como do microbioma das fezes e das cápsulas correspondentes, durante a estocagem a -80°C, visando a definição de um protocolo para produção de cápsulas em série. A análise do microbioma das triplicatas de cada um dos três potenciais doadores não mostrou variação estatisticamente significativa na diversidade alfa entre eles, medida pelo índice de Shannon. Foram avaliados 4 protocolos de produção de cápsulas, 3 dos quais tinham como ingrediente básico, além das fezes, mistura de manteiga de cacau e glicerol, acrescidas ou não de salina 0,9% e que eram dispensados diretamente em invólucros de liberação tardia (DRcaps), de tamanho 00 ou em invólucros de gelatina, tamanho 0, que seriam transferidos posteriormente para os invólucros 00 DRcaps. Além de diferenças na composição de ingredientes, estes protocolos variavam quanto ao procedimento de remoção de resíduos das fezes e homogeneização da mistura. Todos os protocolos implicaram em perda na riqueza e abundância de OTUs, que chegaram a -98%, na comparação entre fezes e cápsulas correspondentes, um deles, adicionalmente, produziu um concentrado fecal sem fluidez insuficiente para a dispensação no invólucro, um deles apresentou baixo rendimento e um terceiro comprometia a estrutura dos invólucros. O protocolo que não apresentou estas limitações técnicas foi testado e aprovado quanto à capacidade de manter a abundância e riqueza de OTUs, durante estocagem das cápsulas por 124 dias, tendo sido o escolhido para a produção em série de cápsulas. Dois dos 3 potenciais doadores de fezes desistiram do processo de seleção, após a análise de seu microbioma fecal. De modo que um deles – na verdade uma potencial doadora – se submeteu aos exames finais para atestar a segurança de seu material fecal, tendo apresentado apenas restrições temporárias, posteriormente revertidas, passou a colaborar com o projeto. Seu microbioma fecal foi confrontado com o microbioma de mucosa de dois pacientes com retocolite ulcerativa, vindo a apresentar profundas diferenças no sentido de apresentar OTUs característicos de uma microbiota saudável, tais como Christensenellaceae, Faecalibacterium e Lachnospiraceae, sendo que estas duas últimas fizeram parte do core microbiome de suas fezes e das cápsulas correspondentes estocadas. A experiência de seleção de doadores, em que, ao final do processo, se conseguiu apenas 1 entre 221 (0,45%) candidatos, mostra uma taxa inferior aos estudos já realizados segundo os quais ~3% ao final são elegíveis.