Carcinoma urotelial: estudo de modificações pós-transcricionais e de proteínas de ligação ao rna - Savio, André Luiz Ventura (2019)
O carcinoma urotelial representa um dos tipos mais comuns de neoplasias urinárias, apresentando altas taxas de recorrência, agressividade e progressão para doença músculo- invasiva. Devido à complexidade dos sistemas biológicos, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares responsáveis pelos carcinomas uroteliais. Nos últimos anos, a introdução de novas ferramentas de bioinformática permitiu identificar novas moléculas e mecanismos implicados na carcinogenese. Neste estudo foram feitas duas abordagens com o objetivo de identificar novos potenciais biomarcadores para tumores uroteliais de baixo e alto graus. Inicialmente, a partir de dados de sequenciamento de RNA, foram avaliados os níveis de expressão gênica e o perfil de splicing do mRNA em amostras tumorais obtidas do biorrepositório da Faculdade de Medicina da USP (FMUSP). Os dados mostraram que os tumores de baixo e alto graus, comparados com tecido saudável de bexiga, apresentavam alteração na expressão em genes da via do TP53, e de splicing de mRNA de genes relacionados a ciclo celular, adesão, migração e processamento do RNA. Os tumores de alto grau, comparados aos de baixo grau, apresentavam aumento da expressão de genes relacionados à quimiotaxia (GREM1, S100A12, NR4A1, IL6, CCL20, CXCL8, S100A9, CXCL10, CXCL11 e CCL7) e a funções neuronais (EPHB2, CNTNAP2, KCNQ3, TENM2, RDH12, DPF1, SHISA9, SLC30A3, MME e MSI1). Além disso, foram identificadas, exclusivamente nos tumores de alto grau, moficações de splicing em fatores de transcrição (GAS5, RPL10, RPL13A e RPL37A), com potencial impacto na produção proteica. Na segunda abordagem, foi realizado estudo funcional refrente ao papel das proteínas de ligação ao RNA (RBPs) na carcinogênese urotelial. Para isso, a partir de 405 casos de carcinomas uroteliais obtidos do The Cancer Genome Atlas - TCGA (384 alto e 21 baixo grau), foram mensurados os níveis de expressão de genes relacionados a 1.542 RBPs. No total, foram identificadas 236 RBPs com potencial atividade oncogênica nos tumores de alto grau, sendo 14 (NOCT, CELF2, ENDOU, EXO1, EZH2, IFIT2, MOV10L1, MSI, PEG10, PTRF, TERT, 11 TRIM71, WARS e YBX2) associadas a pior prognóstico, e selecionadas para o estudo funcional. A validação dos níveis de expressão dessas RBPs revelou que 8/14 (EXO, EZH2, NOCT, TERT, MOV10L1, MSI1, WARS e YBX2) também apresentavam níveis de expressão aumentados nas amostras tumorais obtidas do biorrepositório da FMUSP. A análise funcional em três linhagens celulares (UMUC3, T24 e J82) mostrou que o silenciamento de cada gene codificador das RBPs (total de 14) resultou na diminuição da proliferação e viabilidade celular, e no aumento das taxas de apoptose. Especialmente o silenciamento do gene MSI1 (Musashi-1) mostrou forte impacto na viabilidade, proliferação, migração e invasão celular e apoptose, e também na diminuição da resistência celular a quimio e radioterapias (in vitro). Além disso, a análise de sequenciamento de mRNAs após o silenciamento do MSI1, evidenciou alterações na expressão de genes relacionados à diferenciação de células epiteliais, via Wnt e quimiotaxia. A análise, por CLIP (Crooslinking Immunopreciptation) dos alvos da musashi-1 mostrou que esta preferencialmente a se liga à região 3’UTR e a regiões intrônicas de mRNAs relacionados à tradução, processamento do RNA e às vias Wnt, TP53, PDGF e CCKR. Em conjunto, as duas abordagens permitiram identificar um novo painel de genes candidatos a biomarcadores e um novo alvo terapêutico (musashi1) para tumores uroteliais de alto grau.