Purificação e caracterização de uma xilanase halotolerante de Aspergillus hortai CRM 1919 e aplicação na hidrólise de subprodutos agroindustriais - Gracioli, Michel Ricardo [UNESP] (2018)
As enzimas xilanases são de grande interesse biotecnológico em função da sua habilidade na degradação da molécula de xilana, a principal hemicelulose presente na parede celular de plantas. Tais enzimas encontram aplicações nos mais diversos ramos da indústria como na produção de alimentos e bebidas, de cosméticos, de ração animal, de biocombustíveis entre outros. Em razão da sua composição química, os subprodutos lignocelulósicos, produzidos em grande quantidade pela agroindústria, se apresentam como uma potencial fonte sustentável para a produção de valiosos compostos como biocombustíveis, fertilizantes, rações, produtos químicos e enzimas. Assim, tendo em vista esse contexto, foi desenvolvido o presente trabalho, cujo objetivo foi caracterizar e purificar a principal endoxilanase produzida por uma linhagem de Aspergillus hortai cultivado em estado sólido e aplicá-la, nas formas bruta e purificada, na hidrólise de subprodutos agroindustriais. A purificação da enzima foi alcançada após três etapas cromatográficas, respectivamente, uma cromatografia de troca iônica seguida por cromatografias de interação hidrofóbica e exclusão molecular. Ao final das etapas, a enzima purificada apresentou recuperação de 1,1% e fator de purificação de 15,8 vezes. A enzima bruta e purificada se mostrou tolerante ao NaCl na presença de até 4 M do sal. Por outro lado, foi pouco tolerante à presença de íons e alguns compostos como Hg2+, Cu2+, SDS, Triton X-100 e TWEEN 20/80. Em contrapartida, DTT e β-mercaptoetanol a 10 mM estimularam a atividade da enzima bruta em 13 e 19%, respectivamente. Para a enzima bruta, a temperatura e pH ótimos de reação foram, respectivamente, 60 °C e 6,0 tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 e 2,5 M. Apresentou boa estabilidade térmica a 40 °C na ausência de NaCl, e foi ativada na presença de 0,5 M e 2,5 M do sal durante as 4 h de incubação. A enzima bruta e purificada foi estável em uma ampla faixa de pHs (3,0-8,0) na ausência e na presença de NaCl e apresentou alta especificidade pelas xilanas birchwood, beechwood e oat spelt, não tendo sido detectadas atividades endoglucanase sobre CMC, exoglucanase em Avicel e β-xilosidase em ρNPX. Após a purificação, os perfis de temperatura e pH ótimos de reação se mantiveram em 60 °C e 6, respectivamente. A enzima pura foi, também, bastante estável a temperatura de 40 °C, mantendo mais de 50% da atividade controle durante as 4 h de incubação, e ao pH, variando de 3,0-8,0, na ausência e na presença de NaCl. Xilobiose e xilo-oligossacarídeos superiores foram os produtos formados na hidrólise da xilana oat spelt pela enzima purificada, sugerindo ação enzimática do tipo endoxilanase. A massa molecular aparente, após a purificação, foi estimada em 25,0 kDa por SDS-PAGE e em 14,8 kDa por exclusão molecular. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx em xilana de beechwood sofreram variações em resposta a presença de NaCl, sendo a maior eficiência catalítica obtida na presença de 2,5 M do sal (kcat/km 40,91). A análise da composição química dos subprodutos - sabugo, palha e folha de milho - revelou, respectivamente, 25,6%, 45,3% e 34,9% de carboidratos, 19,7%, 15,2% e 17,6% de lignina e 9,0%, 17,4% e 24,0% de extrativos para a biomassa in natura e, 33,3%, 25,2% e 38,8% de carboidratos e 6,5%, 8,9% e 12,3% de lignina para a xilana extraída desses subprodutos. A extração das hemiceluloses utilizando tratamento alcalino oxidativo resultou em um rendimento de 64% para o sabugo, 18% para a palha e 50% para a folha. A enzima bruta e purificada foi capaz de hidrolisar as biomassas na forma in natura, bem como as xilanas extraídas desse material produzindo majoritariamente xilopentoses e xilohexoses. Sendo assim, pode-se afirmar que a xilanase bruta e purificada em estudo apresentou propriedades interessantes para a aplicação industrial, especialmente na produção de xilo-oligossacarídeos e em processos conduzidos sob elevada salinidade.