Investigação de XenomiRs e RNAs de Candida tropicalis: alvos inovadores para descontaminação na produção de bioetanol - Lourencetti, Natália Manuela Strohmayer (2018)
O processo de fermentação é amplamente utilizado em usinas brasileiras para produção de bioetanol e, mesmo sendo um processo amplamente difundido, a problemática sobre contaminações por micro-organismos ainda é uma incógnita. Problemas de redução de produtividade estão diretamente ligados à competição de nutrientes quando há decorrentes crises de contaminações por bactérias e leveduras não–Saccharomyces. Entre as leveduras contaminantes mais encontradas estão as pertencentes aos gêneros Candida, Torulopis, Rhodotorula, Pichia, Komagataella e Schizosaccharomyces. Muitos antimicrobianos são utilizados para combater contaminações, porém com baixas especificidade e eficiência para leveduras contaminantes. O desenvolvimento de novas alternativas para a descontaminação do processo fermentativo e a busca por biomoléculas naturais e não geradoras de resíduos tóxicos, são emergenciais. Tais biomoléculas podem ser originárias dos miRNAs, que são pequenas moléculas de RNA não codificantes que afetam a estabilidade dos RNAs mensageiros, atuando na expressão de transcritos dentro de processos biológicos, afetando controles transcricionais e pós-transcricionais, resultando na inibição ou potencialização da ação gênica nos processos biológicos fermentativos. Dessa forma, miRNAs livres na dorna de fermentação podem interferir de maneira controlada os contaminantes que competem com a levedura Saccharomyces cerevisiae na produção de bioetanol. Em estudos anteriores de nosso grupo foi selecionada e estudada uma linhagem contaminante de Candida tropicalis, isolada de usina da região de Araraquara/SP, que perseverou durante o período de uma safra. Assim, como continuidade, nosso estudo visou elucidar o comportamento metabólico e transcricional do contaminante relevante, C. tropicalis, durante ciclo de fermentação, através de técnicas de capacidade fermentativa, sequenciamento do RNA global e identificar genes alvos para o desenvolvimento de miRNAs como biomoléculas antifúngicas pela triagem de miRNAs específicos da cana de açúcar em amostras do contaminante C. tropicalis, S. cerevisiae (PE-2) e do caldo de cana (células da planta). Posteriormente, analisar in silico a presença destes genes/alvos identificados em outras espécies de leveduras contaminantes. Para tanto foram realizados estudos de capacitação fermentativa como testes de viabilidade celular (Live/Dead), atividade metabólica (XTT), estudos de assimilação de açúcares (sacarose, glicose e frutose) e produção de etanol por HPLC do contaminante C. tropicalis com a levedura S. cerevisiae (PE-2) para verificar o comportamento competitivo desse contaminante. Assim, os resultados mostraram que a viabilidade do contaminante foi maior que da levedura PE-2 (94% e 81%, respectivamente), em um período de 8 horas de fermentação. A atividade metabólica e assimilação dos açúcares foram equivalentes, mas, para produção de bioetanol foi observado que ambas as linhagens produziram bioetanol ao final de 8 horas, porém, a contaminante de forma significativamente reduzida. Para estudar o comportamento transcricional da contaminante frente à fermentação alcóolica foi realizado sequenciamento de RNA global (RNAseq-MiSeq) e os resultados mostraram um número de genes significativamente expressos, tanto reprimidos quanto induzidos relacionados ao processo de fermentação, como transporte de açúcares, piruvato descarboxilase, metabolismo de aminoácidos, membrana, resistência e também processos ligados à transcrição, evidenciando que a levedura contaminante utiliza toda uma maquinaria de vias fermentativas, para produzir bioetanol. Para o desenvolvimento das biomoléculas antifúngicas foram realizados testes de RT-PCR, através de uma triagem de 25 miRNAs de cana de açúcar, frente a amostras de RNA total do contaminante C. tropicalis, S. cerevisiae e do caldo de cana, retiradas durante a fermentação de 8 horas, afim de elucidar interações importantes no processo fermentativo. Os resultados mostraram 11 miRNAs significativamente expressos, confirmando que interações genéticas através de miRNAs podem ocorrer entre espécies de reinos diferentes. Sendo assim, suas funções foram caracterizadas in silico e por esses resultados, foi realizada a busca de genes/alvos pelo software RNA22. Os dados analisados mostraram que 4 miRNAs (sof-miR159e, sof-miR159a, ssp-miR1128 e sof-miR156) interagiram com 6 genes/alvo (CTRG_00017, CTRG_06114, CTRG_01877, CTRG_05408, CTRG_04160 e CTRG_03746). Duas interações especificas para C. tropicalis foram identificadas por dois miRNAs (sof-miR 159a e sof-miR156) com três genes/alvos (CTRG_06114, 0416 e 03746). Assim, os seis genes/alvos identificados in silíco exibiram por meio do programa Blast alta homologia para C. tropicalis e para diferentes gêneros de leveduras contaminantes não-Saccharomyces. Essa interação foi com aproximadamente 36 diferentes espécies de leveduras potenciais contaminantes de diversos ecossistemas. E por fim, os quatro miRNAs identificados não mostraram interação in silico com os genes de S. cerevisiae, portanto poderiam ser utilizados como biomoléculas antifúngicas potenciais para o controle da contaminação de dornas de fermentação para a produção de bioetanol.