Investigação do efeito da atmosfera gasosa na maturação e fecundação in vitro sobre o metabolismo celular e epigenético de embriões bovinos - Miziara, Carolina (2019)
As tecnologias de reprodução assistida ou ARTs (“Assisted Reproductive Technology”) são amplamente utilizadas na reprodução humana e animal. Para estes procedimentos, gametas e embriões são expostos a um ambiente artificial que mimetiza o trato reprodutivo. Um dos fatores mais discrepantes neste contexto é a atmosfera gasosa, visto que in vivo a concentração de O2 encontrada no trato reprodutivo é menor do que a utilizada no ambiente in vitro, sendo comumente utilizada a concentração de 20% de oxigênio neste sistema artificial. Altas concentrações deste gás provocam estresse oxidativo e aumento das concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, consequente maior proporção de células apoptóticas em oócitos e embriões. Entretanto, pouco se sabe sobre as consequências da mudança de atmosfera gasosa durante as fases iniciais da produção in vitro de embriões e as possíveis consequências no remodelamento epigenético. Para validar a hipótese de que diferentes concentrações de oxigênio durante a maturação e a fecundação in vitro modulam a transcrição de genes envolvidos no estresse oxidativo e modeladores epigenéticos em oócitos, células do cumulus e embriões bovinos. Além disso, o estresse oxidativo gerado nos embriões exerce efeito sobre os níveis globais de metilação do DNA e marcas de histonas, cinco experimentos foram realizados com objetivo de investigar o papel da atmosfera gasosa nos passos iniciais da produção in vitro de embriões bovinos. Para diferenciar os efeitos da tensão de oxigênio nas etapas iniciais da PIVE o desenvolvimento embrionário foi analisado, testando a tensão de oxigênio atmosférica (20% O2) e a baixa tensão de oxigênio (5% O2) na maturação e fecundação in vitro de embriões bovinos. Os grupos formados foram: baixa tensão de O2 na maturação e fecundação in vitro (M5F5), baixa tensão de O2 na maturação e alta tensão na fecundação in vitro (M5F20), alta tensão de O2 na maturação e fecundação in vitro (M20F20) e alta tensão de O2 na maturação e baixa tensão na fecundação in vitro (M20F5). No primeiro experimento, analisou-se o efeito da tensão de oxigênio na maturação in vitro por meio da análise da metáfase II, quantificação da concentração intracelular de EROs e glutationa reduzida (GSH), assim como expressão de mRNAs relacionados a vias de resposta ao estresse oxidativo e remodelamento epigenético em oócitos e células do cumulus. Os resultados iniciais indicaram que oócitos maturados em alta e baixa tensão de O2 não apresentam diferença na maturação nuclear. Oócitos maturados em alta tensão de O2 geram maior concentração de EROs e GSH comparado ao ambiente de baixa tensão de oxigênio. As células do cumulus de oócitos submetidos a alta tensão de oxigênio na maturação in vitro, apresentaram níveis de transcritos maiores para o gene SOD1 relacionado a via de resposta ao estresse oxidativo celular. No segundo experimento, analisou-se o efeito da tensão de oxigênio na fecundação in vitro por meio da análise da taxa de fecundação. A partir dos dados obtidos neste experimento, foi constatado que zigotos expostos a um ambiente de baixa tensão de O2 na FIV não resultam em maior taxa de polispermia. Todos os presumíveis zigotos foram cultivados em baixa tensão de oxigênio até atingirem o estágio de blastocisto. No terceiro experimento, avaliou-se o efeito da tensão de oxigênio na maturação e fecundação in vitro e sua influência no desenvolvimento embrionário. Na taxa de blastocisto, quando houve interação entre ambos os fatores (tensão de oxigênio na MIV e FIV) (one way ANOVA, p≥0.05), a produção de embriões demonstrou que o grupo M20F20 apresentou uma maior produção (50.63 ± 4.55) em relação aos grupos M20F5 (29.66 ± 2.81), M5F5 (32.00 ± 3.27) e M5F20 (31.88 ± 3.99). No entanto, na análise dos efeitos dos fatores (two way ANOVA, p≤0.05), a alta tensão de oxigênio mostrou um efeito benéfico na MIV e FIV através das taxas de desenvolvimento. Na análise de expressão gênica dos blastocistos não houve interação (p>0.05), de modo que os efeitos principais de MIV (p<0.05) diferiram. Alguns genes analisados apresentaram um aumento nos transcritos de embriões que foram maturados em baixa tensão de oxigênio e relacionados a via de resposta ao estresse oxidativo (NRF2, SOD1, SOD2) e remodelamento epigenético (KDM5A e TET1). No quarto experimento deste estudo, demonstrou-se o efeito da tensão de oxigênio a nível intracelular de GSH e EROs em blastocistos. Embriões coletados no dia 7 do desenvolvimento embrionário demonstraram que os níveis intracelulares de GSH foram maiores nos grupos M20F20 e M5F5, em relação aos grupos M20F5 e M5F20. As concentrações intracelulares de EROs foram menores nos grupos M20F20 e M5F5, não existindo diferença entre esses grupos. Já os grupos M20F5 e M5F20 tiveram maior acúmulo de EROs e diferiram entre si. No último experimento deste estudo (V), observou-se o efeito da tensão de oxigênio nos padrões globais de metilação do DNA e marcas de histonas específicas em blastocistos. Na análise dos níveis globais de metilação do DNA, foi encontrado maiores níveis de 5mC nos grupos M5F20 e M5F5, em relação aos grupos M20F5 e M20F20, todos os grupos diferiram entre si. Os níveis de 5hmC foram analisados e a média da intensidade de fluorescência foi superior em embriões do grupo M20F5 e M5F5 comparado aos grupos M5F20 e M20F20, existindo diferença entre os grupos. Na marcação das histonas ambas se comportaram de maneira semelhante, sendo encontrada maiores níveis de H3K9me2/me3 em embriões dos grupos M5F5 e M20F20, em relação a M5F20 e M20F5, existindo diferença entre os grupos. Em conclusão, este estudo elucidou as diferenças que a alta e a baixa tensão de oxigênio podem provocar nas fases iniciais da produção in vitro de embriões bovinos e possíveis consequências na homeostase celular. Contribuiu para o entendimento dos mecanismos básicos da interação ambiente e genoma, além da aplicação dos conhecimentos adquiridos para a melhoria de biotecnologias nas etapas iniciais da produção in vitro de embriões bovinos.