Caracterização funcional e estrutural das proteínas RUV-1 e RUV-2 do fungo Neurospora crassa - Mateos, Pablo Acera [UNESP] (2016)
Neste trabalho foi realizado um estudo de caracterização das proteínas RUV-1 e RUV-2 de Neurospora crassa, as quais são proteínas ubiquamente encontradas e descritas estar envolvidas em diferentes processos celulares. Resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo identificaram, através de espectrometria de massas, a proteína RUV-1 como uma proteína capaz de se ligar ao promotor do gene da glicogênio sintase (gsn) durante a resposta ao choque térmico. Mais tarde, foi demonstrado que a proteína foi capaz de se ligar in vitro, e de maneira especifica, ao motivo de DNA STRE, também presente no promotor gsn. Considerando que a proteína RUV-1 interage com a proteína parceira RUV-2 e, juntas, participam de grandes complexos proteicos que atuam na regulação de diferentes processos celulares, este trabalho teve como objetivo realizar estudos de caracterização das proteínas RUV-1 e RUV-2. Os resultados de expressão gênica mostraram que o gene ruv-1 foi superexpresso na condição de choque térmico e que o gene ruv-2 não mostrou alteração na expressão na mesma condição. Além disso, foi demonstrado que o transcrito do gene ruv-2 é parcialmente processado na situação de choque térmico, e não em outra condição indutora de estresse, através do processo conhecido como intron retention levando à síntese de uma proteína truncada. No entanto, os resultados mostraram que a proteína RUV-2 foi detectada em extratos celulares do fungo obtidos até 4 h de choque térmico. Os cDNAs (ruv-1 e ruv-2) foram inseridos no vetor pET28a e as proteínas expressas em E. coli. Entretanto, ainda não foi finalizada a expressão de ambas utilizando o plasmídeo bicistrônico pETDUET-1, para a análise de interação de ambas proteínas. Neste trabalho também foi construída uma linhagem do fungo modificada geneticamente, a qual produz a proteína RUV-1 fusionada ao tag V5 (RUV-1-V5) e será posteriormente utilizada em ensaio de imunoprecipitação para identificação de proteínas parceiras. Ensaios de imunoprecipatação de cromatina (ChIP) com esta linhagem foram realizados com o objetivo de analisar se a proteína RUV-1 se liga in vivo ao mesmo fragmento de DNA. Entretanto, os experimentos ainda não permitiram identificar a ligação proteína-DNA. Análises de modelagem e dinâmica molecular das proteínas RUV-1 e RUV-2 de N. crassa sugeriram interação entre elas e homologia estrutural a outras proteínas RUV conhecidas