Proteínas de interação da EPPIN no espermatozoide de camundongos: identificação, expressão e potenciais papeis fisiológicos - Mariani, Noemia Aparecida Partelli (2019)
A EPPIN (do inglês, Epididymal peptidase inhibitor), proteína antimicrobiana rica em resíduos de cisteína contendo duas sequências consenso de domínios de inibidores de protease do tipo WFDC e Kunitz, é um alvo farmacológico para o desenvolvimento de novos contraceptivos masculinos devido ao seu papel crítico na motilidade do espermatozoide. O desenvolvimento de fármacos contraceptivos baseados nas funções da EPPIN requer um entendimento mais profundo a respeito dos seus mecanismos fisiológicos e posterior avaliação da eficácia e segurança da potencial droga em modelos pré-clínicos. No presente estudo, investigamos o perfil de expressão da EPPIN em tecidos e em espermatozoides testiculares e epididimários de camundongos e identificamos potenciais proteínas que interagem com a EPPIN no espermatozoide maduro. Para caracterizar o perfil de expressão da EPPIN, processamos órgãos reprodutivos e não-reprodutivos, além de espermatozoides para ensaios de RT-PCR, qPCR, Western blot e imuno-histoquímica/imunofluorescência. Para a identificação dos parceiros de ligação da EPPIN, coletamos espermatozoides do corpo/cauda do epidídimo e incubamos as células com a fração solúvel em tampão fosfato do fluído da glândula seminal dos mesmos animais. Realizamos ensaios de co-imunoprecipitação utilizando anticorpo anti-EPPIN Q20E ou IgG de coelho (controle negativo) para imunoprecipitar a EPPIN e co-imunoprecipitar suas proteínas parceiras, processamos as amostras para digestão de proteínas com tripsina e identificamos os peptídeos trípticos por espectrometria de massas (LC-MS/MS). Nossos resultados mostraram que a expressão da EPPIN (RNAm e proteína) é dependente do nível de andrógenos, abundantemente expressa no testículo e epidídimo, mas também presente no ducto deferente, glândula seminal e glândula adrenal de camundongos. Observamos também imunomarcação positiva para a EPPIN na região acrossômica e flagelo de espermatozoides epididimários, sugerindo potenciais ações na reação acrossômica e motilidade espermática. A co-imunoprecipitação com anticorpo anti-EPPIN e posterior análise por LC-MS/MS e Western blot utilizando espermatozoides epididimários maduros pré-incubados com fluído da glândula seminal revelou que as proteínas SVS2, SVS3a, SVS5 e SVS6 secretadas pela glândula seminal são potenciais proteínas de interação da EPPIN na superfície do espermatozoide. Realizamos ensaios de Western blot das amostras obtidas nos ensaios de co-imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-EPPIN, anti-SVS2 e anti-SVS3 para confirmação dos resultados e ensaios de Far-Western blot com as proteínas EPPIN e SVS2 recombinantes para investigar a potencial interação proteica. Esses dados sugerem que a EPPIN é uma proteína que atua em complexos proteicos na superfície do espermatozoide de camundongos. Nossos resultados fornecem novas informações sobre os papéis fisiológicos da EPPIN em machos e destacam sua importância para interações proteína-proteína no espermatozoide, as quais podem proteger e preparar o gameta masculino durante sua jornada pelo sistema reprodutor feminino e facilitar o processo de fertilização. Além disso, nossos dados sustentam a viabilidade do camundongo como modelo experimental adequado para estudar as funções e mecanismos fisiológicos da EPPIN, bem como para o avanço no seu desenvolvimento como alvo farmacológico para contracepção masculina.