Expressão de genes relacionados a virulência e envolvidos na síntese de ergosterol de Candida albicans resistente a fluconazol submetidos à terapia fotodinâmica associada ao antifúngico - Jordão, Cláudia Carolina (2019)
O estudo tem como objetivo avaliar a susceptibilidade ao fluconazol e a expressão de genes de virulência e envolvidos na síntese de ergosterol de cepa de Candida albicans resistente a fluconazol (ATCC 96901) presentes nas línguas de camundongos submetidos à aPDT associada a Nistatina. Para isso, colônias recuperadas de animais submetidos ao tratamento com aPDT e Nistatina (NIS) bem como a associação (NIS+aPDT e aPDT+NIS), foram armazenadas em glicerol 50% e utilizadas para o Teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM). Além disso, as línguas dos animais submetidos aos tratamentos foram armazenadas em RNAlater (RNAlater Tissue Collection: RNA Stabilization Solution Protocol Ambion®) em freezer -80°C para avaliação da expressão gênica. Para realização do teste CIM, as cepas foram reativadas em placas de Ágar Sabouraud Dextrose (SDA), cultivadas em estufa 35°C por 48 h e avaliadas seguindo o método de microdiluição em caldo (CLSI) com algumas modificações. Foram realizadas diluições seriadas de fluconazol (variando de 2 a 1024 μg/ml) em meio RPMI 1640 (2 x concentrado), em suspensões (0,5x103 a 2,5x103 UFC/mL). As placas foram incubadas a 35°C e observadas quanto à presença ou ausência de crescimento após 24 h, além disso, foi realizado plaqueamento (CFM). Foram consideradas as menores concentrações de fluconazol que resultaram em inibição de pelo menos 50% do crescimento. A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio da técnica quantitativa de Transcrição Reversa da reação em cadeia de polimerase (RT-qPCR) utilizando primers específicos para os genes de virulência (ALS1; HWP1; EFG1; CAP1; CAT1; SOD1; SAP1; PLB1 e LIP3) e genes envolvidos na síntese do ergosterol (ERG1; ERG11; ERG3 e ERG25). Novos primers para os genes ERGs foram desenhados (Oligo Software™) a partir de seqüências obtidas do "Pubmed". Os primers foram sintetizados e testados in vitro pela técnica de PCR utilizando um painel de DNA genômico de diferentes espécies de Candida, com seus produtos visualizados em gel de agarose. Reações de qPCR foram realizadas para determinar a concentração ótima e a eficiência dos primers. Para análise da expressão gênica, as línguas foram submetidas à extração e purificação de RNA. O cDNA foi sintetizado e a técnica de RT-qPCR realizada. Os dados de CFM e expressão foram analisados por Análise de Variância (α = 0,05). Os resultados do CFM pós CIM foram avaliados por ANOVA seguida do pós-teste de Tukey (α=0,05). Foi verificado que, independente do tratamento aplicado e do momento da coleta (24h ou 7 dias após tratamento), as cepas recuperadas foram semelhantes ao grupo P-L-(animais sem tratamento). Demonstrando que não houve modificação do perfil de resistência da cepa ao fluconazol nas concentrações testadas. Em relação a expressão gênica, os primers delineados não foram específicos somente para C. albicans. No presente estudo, foi observado que os genes ERG1, ERG3, ERG11 e ERG25 apresentaram comportamento semelhante, com redução da expressão gênica nos grupos onde foram realizados os tratamentos em comparação com o grupo controle (P-L-). Os resultados demonstraram que os tratamentos reduziram a expressão dos genes ALS1, EFG1, CAP1, LIP3, SAP1 e SOD1 em todos os grupos experimentais avaliados em relação ao controle (P-L-). Quando utilizada a terapia combinada (aPDT+NIS, NIS+aPDT), houve redução mais acentuada na expressão dos genes ALS1, LIP3, SAP1 e SOD1. A expressão do gene EFG1, foi estatisticamente semelhante em todos os grupos de tratamento e menor que no grupo controle (P-L-). Para os genes CAT1 e SOD1, não foi observada diferença estatística entre os grupos aPDT e aPDT+NIS. Para os genes CAP1, EFG1, HWP1 e LIP3, os grupos P-L+ e aPDT não apresentaram diferença estatística entre si. Para os genes CAP1, EFG1 e HWP1 não houve diferença estatística entre os grupos de tratamento NIS e os que foram avaliados a associação das terapias (NIS+aPDT e aPDT+NIS). Não houve expressão detectada para o gene PLB1. A associação de terapias não alterou a susceptibilidade fúngica ao fluconazol e reduziu a expressão dos genes ERG1, ERG3, ERG11, ERG25, ALS1, EFG1, SAP1, LIP3, CAP1 e SOD1.