Isolamento e análise in silico de nova subclasse de parasporina do tipo 4 de Bacillus thuringiensis coreanensis e sua potencial aplicação biotecnológica - Santos, Thais Nayara Ferreira dos (2024)
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva que possui suas linhagens estudadas principalmente para o controle de insetos-praga. Porém, recentes estudos apontam a presença de outras proteínas sem ação inseticida conhecida. Essas proteínas denominadas “parasporinas” (PS) possuem atividade citotóxica e apresentam seis classes, sendo PS1, PS2, PS3, PS4, PS5 e PS6. Entre essas a PS4 apresenta somente uma subclasse descrita, presente na linhagem Bacillus thuringiensis shandongiensis. Dado ao pouco conhecimento sobre as ações das proteínas PS4 e a existência de somente uma subclasse descrita, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização da linhagem Bacillus thuringiensis coreanensis como potencial fonte da proteína PS4. A partir do DNA total extraído dessa linhagem, o gene ps4 foi isolado, clonado e análises in silico de sua sequência foram realizadas. Nessas análises foram utilizadas ferramentas como Bioedit, BLAST, Clustal Omega, Geneious, IQ-Tree e iTOL. Para a análise estrutural da PS4 encontrada, em comparação a PS4 do banco de dados (BAD22577), foram utilizadas as ferramentas Alphafold2, Pymol e InterPro. Análises em gel de SDS-PAGE permitiram a visualização da proteína PS4 de B.t. coreanensis inativa e ativa, após solubilização e ativação com Proteinase K. Foram efetuados bioensaios com o inseto-praga Spodoptera frugiperda utilizando cultura crescida das linhagens B.t. coreanensis, B.t. shandongiensis e B.t. kurstaki HD-73 para testar sua efetividade como linhagem inseticida. Foram também realizadas análises morfológicas das inclusões cristalinas dessas mesmas linhagens para visualização da diferença entre seus tipos de cristais em microscopia de varredura. A análise in silico da sequência obtida revelou similaridade de 92,03% com a sequências de ps4 presente no banco de dados (AB180980). Os bioensaios mostraram a atividade não inseticida da linhagem B.t. coreanensis frente ao inseto-praga, semelhante ao que ocorreu com B.t. shandongiensis, já caracterizado como portador da proteína PS4 e diferente da linhagem B.t. kurstaki, que apresentou um alto poder inseticida como previsto na literatura. Os estudos de modelagem das proteínas e a comparação de suas estruturas revelaram que a linhagem de B.t. coreanensis possui uma nova subclasse de PS4, denominada PS4Ab1, sendo importante fonte de parasporina a ser explorada em aplicações biotecnológicas.