Caracterização da região MHM em aves: padrões diferenciais de metilação em machos e fêmeas - Jeronimo, Bruna Cristina [UNESP] (2016)
Em contraste ao padrão de cromossomos sexuais de mamíferos (XX/XY), as aves apresentam um sistema de determinação sexual em que os machos representam o sexo homogamético (ZZ) e as fêmeas constituem o sexo heterogamético (ZW). Adicionalmente, embora mamíferos apresentem um mecanismo de compensação de dose, a inativação completa de um dos cromossomos Z não é observada em machos de aves e, portanto, estes possuem um maior nível de expressão de vários genes presentes nesse cromossomo. A despeito disso, um mecanismo ainda não completamente esclarecido de compensação de dose parcial em aves resulta em expressão equivalente entre os sexos para alguns genes do cromossomo Z. A região MHM (Male Hypermethylated), localizada no cromossomo Z de Galliformes, está associada a um padrão de hipermetilação em machos e hipometilação em fêmeas, levando à síntese de um RNA não-codificante longo (lncRNA) somente em fêmeas. A presença deste lncRNA é associada ao aumento da expressão de genes próximos à região MHM em fêmeas, o que parece resultar em uma compensação de dose local entre os sexos. Dado que, até o momento, segmentos MHM foram somente identificados em Galiformes e Anseriformes, o presente estudo visou isolar e caracterizar esta região em Galliformes (galinha doméstica, codorna européia, peru) e também em Struthioniformes (avestruz), Strigiformes (coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-da-igreja, coruja-buraqueira), Piciformes (tucanuçu), Psittaciformes (arara-azul-grande) e Apodiformes (beija-flor-da-banda-branca, beija-flor-tesoura, beija-flor-preto). Indivíduos adultos e embriões com seis dias de desenvolvimento foram sexados com base em caracteres morfológicos e moleculares - por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificação de uma região intrônica dos genes CHD1-Z e CHD1-W, seguida de eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, análise SSCP e análise automatizada de fragmentos de DNA. Métodos de sexagem molecular mostraram-se adequados para identificação de machos e fêmeas de galinha doméstica, codorna européia, peru, tucanuçu, arara-azul-grande, coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-buraqueira, beija-flor-da-banda-branca, beija-flor-tesoura e beija-flor-preto. Entretanto, as técnicas moleculares utilizadas não permitiram identificar diferenças entre machos e fêmeas de avestruz. Análises in silico da região MHM de galinha doméstica mostraram que esta se encontra localizada no braço curto do cromossomo Z, sendo constituída por 260Kb (chrZ:27,000,000-27,260,000) e alto conteúdo de CG. Esta região é delimitada por duas LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) e possui múltiplos elementos repetitivos da classe LTR (Long Terminal Repeat), especialmente os pertencentes à família EVRL (Endogenous Retrovirus), denominados GGLTR5A. Com base em sua composição genômica, a região MHM de galinha doméstica foi subdividida em sub-regiões - denominadas de 1 (chrZ:27,176,712-27,260,282), 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), 3a (chrZ:27,094,512-27,132,043), 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511) e 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) - que apresentam-se compostas por três unidades de repetições diferentes (denominadas de repeats 1, 2 e 3) flanqueadas por LTRs específicas. PCR multiplex em amostras de galinha doméstica levou à amplificação de dois fragmentos de DNA de aproximadamente 240 e 750 pares de bases, sendo o fragmento maior correspondente à repeat 1 da região MHM. Assim como observado para galinha doméstica, também foram gerados, via PCR, dois fragmentos de DNA de diferentes tamanhos associados à região MHM para as outras espécies de aves estudadas. Um maior nível de identidade (80-97%) foi observado entre a região MHM de galinha doméstica e as sequências nucleotídicas obtidas de codorna européia, peru e avestruz, o que demonstra que a presença de segmentos MHM não se restringe ao genoma de Galliformes e Anseriformes. Ensaios de digestão enzimática em DNA genômico de galinha doméstica, codorna européia e peru, por meio do uso de endonucleases de restrição sensíveis à metilação e dependentes de metilação (MspI, HpaII e McrBC), seguidos de amplificação de um fragmento de DNA associado à sub-região 1 MHM, evidenciaram padrões diferenciais de metilação dessa região entre os sexos, sendo hipometilada em fêmeas e hipermetilada em machos. Tais padrões diferenciais mostram-se potencialmente adequados para aplicação em testes de sexagem molecular em espécies de aves.