LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DE PROTEÍNAS DE Xanthomonas citri subsp. citri UTILIZANDO PROTEÍNA REPÓRTER - Pena, Michelle Mendonça [UNESP] (2019)
Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é uma bactéria fitopatogênica, conhecida por causar Cancro Cítrico Asiático (CCA) na maioria das espécies economicamente importantes de citros. A bactéria possui em seu genoma inúmeros genes que codificam para proteínas sem função descrita. A elucidação da localização subcelular e da função dessas proteínas são uma importante estratégia para o entendimento dos mecanismos e vias envolvidos na interação planta-patógeno. Assim, um vetor integrativo (pMAJIIc) contendo a proteína vermelha fluorescente mCherry foi construído com o objetivo de possibilitar a expressão e localização intracelular de proteínas de X. citri fusionadas a mCherry. O vetor pMAJIIc se integra no gene da α-amilase de X. citri, mas a interrupção do gene α-amilase não afetou a patogenicidade e a virulência da bactéria e a integração do vetor ao cromossomo bacteriano se manteve estável ao longo de diversas gerações. Com este vetor foi possível demonstrar em X. citri um padrão de emissão de fluorescência para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas. A proteína VrpA fusionada a mCherry foi visualizada circundando a membrana externa bacteriana, enquanto a proteína GyrB fusionada a mCherry foi visualizada difusa pelo citoplasma, com alguns pontos de acumulação localizados próximos aos polos da célula. O vetor também foi utilizado para a caracterização e localização subcelular da proteína hipotética XAC0024 de X. citri, agora anotada como EnvC. O mutante para o gene envC (ΔenvC) apresentou virulência reduzida e atraso no desenvolvimento das lesões típicas de cancro cítrico quando inoculado em folhas de limão cravo (Citrus limonia Osbeck). Além disso, o mutante ΔenvC apresentou células morfologicamente alteradas, com formato filamentoso e formação de minicélulas, indicando que essa proteína é um dos fatores responsáveis pela correta separação de células filhas bacterianas. A localização subcelular da proteína EnvC fusionada a mCherry apresentou o padrão descrito para proteínas periplasmáticas, sendo visualizada circundando a membrana externa bacteriana. Assim, pela primeira vez demonstramos que fusões com mCherry para localização subcelular de proteínas em X. citri utilizando vetor integrativo permite a identificação de um padrão de emissão de fluorescência específico para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas, o que tornou possível a caracterização de uma proteína até então sem função conhecida em X. citri