Purificação e imobilização de β-glicosidase do fungo Thermoascus aurantiacus em criogéis supermacroporosos - Mól, Paula Chequer Gouveia (2021)
As β-glicosidases são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas β-(1,4) terminais, função essencial a muitos processos biológicos, sendo, portanto, de grande interesse para a bioquímica e a biotecnologia. Este trabalho teve como objetivo a obtenção e o posterior estudo da purificação e imobilização da β-glicosidase do fungo termofilico Thermoascus aurantiacus em suportes supermacroporosos de poliacrilamida produzidos em condições de congelamento (conhecidos como criogel). A enzima foi produzida por fermentação em estado sólido utilizando sabugo de milho como substrato. A primeira coluna utilizada (Capítulo II) foi obtida por modificação química do criogel pela introdução dos grupos iônicos 2-(dimetilamino)etil metacrilamida (DMAEMA). Os experimentos de adsorção foram realizados em diferentes valores de pH e os resultados de rendimento (%) e fator de purificação foram calculados e submetidos a ANOVA a 95% de significância. O pH teve efeito significativo (p<0,05) no rendimento, sendo que o melhor resultado foi obtido em pH 5,0 (82%). O fator de purificação não variou e os resultados foram considerados baixos uma que vez que a eluição utilizada foi isocrática (1,25-1,33). Entretanto, por meio de SDS-PAGE verificou-se que o extrato bruto foi parcialmente purificado, independentemente do valor de pH. A segunda coluna sintetizada (Capítulo III) foi obtida pela incorporação do aminoácido L-fenilalanina na superfície do criogel, e utilizada em testes de imobilização de β-glicosidase via interação hidrofóbica. A adsorção foi inicialmente estudada em função do pH e verificou-se que o maior fator de purificação foi obtido em pH 3,0. Em seguida, o efeito da temperatura e da forca iônica de diferentes soluções salinas na adsorção e consequentemente na atividade da enzima imobilizada foi avaliado. Além disso, a reutilização do biocatalisador foi investigada por sete ciclos consecutivos e não foi observado decréscimo na sua atividade específica. Nos dois casos, as colunas de criogéis produzidos foram caracterizadas em termos de suas propriedades morfológicas e hidrodinâmicas. Os resultados obtidos no trabalho mostram que os criogéis produzidos podem ser um potencial meio de separação e imobilização de proteínas.