Estudo da proteína espermática EPPIN como alvo para contracepção masculina: caracterização estrutural, interação proteína-proteína e potenciais mecanismos de ação. - Mariani, Noemia Aparecida Partelli [UNESP] (2024)
A EPPIN (Epididymal protease inhibitor) é um alvo farmacológico para contracepção masculina, devido ao seu papel crítico na função do espermatozoide. A EPPIN é expressa pelas células testiculares e epididimárias, e está presente na superfície dos espermatozoides humanos, onde atua inibindo a motilidade espermática após a ejaculação via interação com a proteína seminal semenogelina-1 (SEMG1). Pouco se conhece, no entanto, sobre os mecanismos pelos quais a EPPIN modula a motilidade espermática, bem como seus papeis adicionais na reprodução. Recentemente, demonstramos um sistema equivalente de interação EPPIN/SEMG1 no espermatozoide murino, o que indica que a EPPIN também tem papel no controle da motilidade espermática nessa espécie. Neste projeto, nosso objetivo foi investigar o papel da EPPIN na função do espermatozoide murino, com ênfase no seu perfil de interação com a SEMG1 e potenciais mecanismos de ação no controle da motilidade espermática. Ensaios de interação proteína-proteína confirmaram a interação entre a EPPIN e SEMG1 murina recombinantes (EPPINm e SEMG1m, sequências inteiras sem o peptídeo sinal), sendo que o fragmento recombinante R98-G375 da SEMG1 (SEMG1mR98-G375) interagiu com a EPPIN de maneira similar à SEMG1m inteira, enquanto os fragmentos Q32-V118 (SEMG1mQ32-V118) e Y221-G375 (SEMG1mY221-G375) tiveram porcentagem de ligação à EPPINm de somente 20% e 30%, respectivamente. Ensaios de CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) revelaram que a SEMG1m inibiu a motilidade progressiva [IC50 = 13,5 µM (0,9-194,2); média (95% de intervalo de confiança)], e hiperativada [IC50 = 6,8 µM (1,4-32,9)] de forma dependente da concentração. Interessantemente, tanto o fragmento SEMG1mR98-G375, que contém o principal domínio de interação com a EPPIN, quanto o SEMG1mQ32-V118 inibiram a hiperativação. O efeito inibitório da SEMG1m sobre a hiperativação espermática foi associado à inibição do canal de Ca2+ específico do espermatozoide CatSper, conforme demonstrado por ensaios de eletrofisiologia para avaliar a corrente deste canal no espermatozoide murino. Consistentemente com esses achados, ensaios de Western blot e imunofluorescência revelaram a presença da EPPIN e SEMG1 nos espermatozoides isolados de diferentes regiões do trato reprodutor feminino após a ejaculação. Observamos colocalização da EPPIN com a SEMG1 na cabeça e flagelo de espermatozoides isolados da vagina e útero, porém em menor grau para os espermatozoides isolados de regiões próximas ao oviduto. Nossos resultados demonstram que a inibição da hiperativação espermática induzida pela SEMG1 está relacionada à inibição do CatSper, um efeito que, embora associado, não depende apenas da sua ligação à EPPIN. A identificação das sequências-chave da SEMG1 necessárias para a sua ligação à EPPIN (R98-S220), e inibição da hiperativação (Q32-S220) via inibição do canal CatSper, pode facilitar o desenvolvimento de novas moléculas capazes de mimetizar os efeitos dessa proteína sobre a função espermática, promovendo inovações significativas na descoberta e desenho de novos fármacos com potencial contraceptivo masculino não-hormonal.