Estudos biofísicos da hemocianina do camarão Macrobachium acanthurus (HcMac) na presença de agentes caotrópicos e atividade biológica - Ramos, Lierge (2022)
As hemocianinas (Hcs) são grandes proteínas extracelulares responsáveis por inúmeras funções em artrópodes e moluscos. Representam cerca de 50 – 90% da hemolinfa, e tem como principais funções, o transporte de O2 e atuar no mecanismo de defesa imunológica. Em geral, as Hcs mantem sua integridade funcional e estrutural em uma ampla faixa de temperatura (entre -20 e 90ºC) e apresentam atividade fenoloxidase (PO) latente quando o animal é exposto a condições de estresse. Em artrópodes, as Hcs apresentam-se na forma de seis cadeias monoméricas agregadas, na forma de um hexâmero ou oligohexâmeros contendo até oito hexâmeros (8 × hexâmeros). Assim, o objetivo geral deste projeto de doutorado foi purificar, caracterizar, avaliar atividade biológica e PO da Hc do camarão Macrobrachium acanthurus (HcMac). Para estes estudos foram realizados cromatografia líquida de exclusão molecular, eletroforese monodimensional SDS-PAGE, AUC (do inglês Analytical Utracentrifugation), MALDI-TOF-MS (do inglês Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), medidas espectroscópicas variando o pH, concentração de ureia e SDS (dodecil sulfato de sódio), e estudos de atividade PO e antimicrobiana. Os resultados dos experimentos de SDS-PAGE, AUC e MALDI-TOF-MS indicam que a HcMac é formada por cadeias polipeptídicas de 75 - 76 kDa formando uma estrutura de 450 kDa, ou seja, um hexâmero é composto por 6 cadeias monomérica de 75 KDa (1×hexâmero). As medidas UV-vis mostraram que a afinidade do centro di-cobre pelo oxigênio é dependente do valor de pH. Os resultados de emissão de fluorescência indicaram alterações na estrutura terciária da proteína devido às mudanças do valor de pH do meio, sendo que este influenciou na exposição dos resíduos de Triptofano ao solvente. Através das análises de intensidade de espalhamento de luz (LSI – do inglês Ligth Scathering Intensity) medidas no espectrofluorímetro foi possível sugerir que a HcMac apresenta ponto isoelétrico entre 4,3 e 5,3, assim como a hemocianina de outros camarões. A ureia induziu o processo de desnaturação, mas em pH 7,0 a HcMac demonstrou ser mais estável e foi necessário uma concentração maior de desnaturante em relação ao pH 5,0. A ureia e o SDS reduziram a intensidade de fluorescência, deslocaram o comprimento de onda máximo (λmax) para valores maiores, devido ao processo de dissociação, que expôs o centro di-cobre da hemoproteína (cobre é supressor de fluorescência), além de favorecer a exposição do Triptofano ao solvente. Os resultados de LSI da HcMac mostram que em pH 5,0 houve uma forte interação entre proteína-SDS em concentrações inferiores a 1,0 mmo.L-1, pois a LSI aumentou em 12 vezes sua intensidade em relação HcMac pura em solução. A HcMac nativa apresentou atividade PO induzida pelo surfactante SDS e não demonstrou ação antimicrobiana nos testes realizados. Os resultados obtidos até o momento são relevantes, pois trazem informações importantes para avançarmos nos estudos de caracterização e aplicação biotecnológica da HcMac.