Perfil transcricional da criotolerância de embriões produzidos in vitro - Caetano, Diana Pedroso (2018)
A criotolerância embrionária é um processo complexo que envolve mudanças estruturais e moleculares dinâmicas. Informações a respeito do perfil transcricional embrionário após a criopreservação ainda são insuficientes. O objetivo deste trabalho foi estabelecer o transcriptoma de blastocistos bovinos produzidos in vitro com alta e baixa criotolerância. Oócitos imaturos (n = 3926) foram recuperados de ovários derivados de abatedouro e maturados, fertilizados e cultivados in vitro sob condições padrão. A clivagem e produção de embriões foram registrados no dia três e sete após a fertilização. Blastocistos expandidos (n = 894) com qualidade excepcional (apenas grau I) foram vitrificados pelo método Cryotop. Os blastocistos vitrificados foram aquecidos, e a re-expansão e eclosão dos embriões foram registradas às 6 e 12h após o aquecimento, respectivamente. Uma rigorosa avaliação morfológica foi realizada e os embriões foram classificados em alta criotolerância (HC), re- expandido e baixa criotolerância (LC) após a criopreservação. A fim de aumentar a precisão das diferenças moleculares entre fenótipos, apenas blastocistos HC e LC (n = 3, total de 123 blastocistos por grupo, pool de 41/amostra) após a criopreservação foram submetidos à extração total de RNA (PicoPure, Applied Biosystems®). O RNA extraído foi avaliado através do 2100- Bioanalyzer (Agilent Technologies®). Somente amostras com integridade de RNA ≥ 7,7 foram submetidas ao protocolo padrão de preparação da biblioteca NEBNext Ultra II (New England Biolabs®) e RNAseq (Illumina®). Os dados foram limpos (seqyClean v1.3.12), mapeados (Tophat v.2.0.8), as leituras contadas (HTSeq-count v0.5.4p2), e foi realizada análise de expressão diferencial (DESEq v1.12.1 de R/Bioconductor). Para análise de enriquecimento gênico, foi utilizado o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA). As taxas de clivagem e produção de blastocistos foram 73,2% (2873/3926) e 29,0% (1137/3926), respectivamente. As taxas de re-expansão (89,2 vs. 73,4%) e de eclosão (23,7 vs. 8,4) foram maiores (P<0,05) às 12h em comparação com 6 h após o aquecimento, respectivamente. Uma média total de 17,8 milhões de leituras por amostra foi utilizada na análise de expressão diferencial. As amostras dos grupos de blastocistos HC e LC foram claramente separadas com individualização pronunciada na análise de componentes principais bi e tridimensionais e agrupamento de “Heat Map” sustentando a caracterização fenotípica do modelo (alta versus baixa criotolerância). Um total de 9.422 genes foram identificados, 114 genes foram diferencialmente expressos (GDE; FDR: P <0,05), com 27 e 84 genes superexpressos em HC e LC, respectivamente. Na análise de enriquecimento dos GDEs (FDR: P <0,1), as cinco principais funções biológicas identificadas foram movimento celular, o desenvolvimento celula, proliferação e crescimento celular e sobrevivência e morte celular. Na análise de predição do IPA, as funções biológicas de sobrevivência do organismo, sobrevivência e morte celular, crescimento e proliferação celular foram preditas como sendo mais ativadas (z-score ≥ +2), enquanto movimento celular e a sinalização célula a célula foram preditos mais inibidos (z-score ≤ -2). O presente trabalho forneceu uma análise abrangente do perfil transcricional da criotolerância de embriões bovinos e elucidou o envolvimento de um grande número de processos biológicos nobres na retomada do desenvolvimento após a criopreservação. Sobrevivência do organismo, movimento celular, sobrevivência e morte celular, crescimento e proliferação celular foram funções biológicas cruciais para a criopreservação de embriões.