O uso de baculovírus como ferramenta para produção de antígenos vacinais e kits diagnósticos de doenças humanas : raiva, febre amarela, dengue e zika - Baggio, Mayarha Patricia Dequigiovanni (2019)
O sistema de expressão em células de insetos utilizando baculovírus (BEVS) tem sido amplamente utilizado para uma variedade de aplicações, incluindo o uso como biopesticidas modificados, produção de proteína recombinante, expressão transitória de transgenes, e expressão de antígenos para uso vacinal ou em diagnóstico. Além da vantagem da produção de proteína heteróloga em grande escala com modificação pós-traducional eucariótica apropriada, as proteínas heterológas também podem ser exibidas no envelope viral. Esta tecnologia de apresentação na superfície preserva a estrutura multimérica nativa da proteína, expandindo assim a utilidade clínica e farmacêutica do sistema de baculovírus. No capítulo I, deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo um peptídeo imunogênico derivado da GPV (Glicoproteína) do vírus da raiva fusionado à proteína GP64 do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV). A GPV interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da expressão da proteína recombinante (GP64Ag + GPV) por Western blot e imunomarcação na microscopia confocal. No capítulo II, o sistema BEVS foi utilizado para expressar o EDIII (domínio III), da proteína de envelope do vírus da febre amarela, fusionado à proteína poliedrina de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão da proteína recombinante (Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. As partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. As análises imunológicas mostraram uma resposta imune específica a Th1/Th17 frente ao antígeno em camundongos após a imunização. Também foi observado que a proteína pode atuar como adjuvante durante a imunização e que desencadeia uma resposta imunológica específica. Assim este resultado sugere um possível uso deste recombinante como imunógeno. No capítulo III, foi avaliado a expressão de proteínas NS1 (proteína não-estrutural 1) recombinantes dos flavivírus Zika (ZIKV) e dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) em células de inseto e seu uso como insumos para diagnóstico através da detecção do anticorpo anti-NS1 de DENV, no plasma de pacientes infectados. A proteína NS1 é secretada e circula no plasma no início da fase febril da doença, e pacientes produzem anticorpos específicos ao NS1 de flavívirus, além de anticorpos contra proteínas estruturais. Desta forma, peptídeos imunogênicos de NS1 de DENV 1, - 2, - 3 e 4 e ZIKV foram fusionados com a proteína poliedrina de AcMNPV e suas proteínas expressas foram purificadas com Tween 20 5% e confirmadas por Western blot, microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. Para avaliar o efeito do antígeno frente ao soro de pacientes infectados com dengue, foi utilizado o método Elisa indireto que revelou sensibilidade alta dos antígenos. Testes complementares serão necessários para sua validação, mas acredita-se que esta estratégia pode proporcionar uma melhora na diagnose e na evolução do quadro dos pacientes acometidos.