Purificação e caracterização bioquímica de β-glicosidases de Penicillium chrysogenum e sua aplicação na suplementação de coquetéis enzimáticos para a hidrólise de biomassas - Costa, Samara Graciane da (2013)
β-glicosidases tem recebido atenção em vários campos por causa de suas aplicações práticas. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer as condições de cultivo de P. chrysogenum em meio liquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono, purificar e caracterizar as β-glicosidases secretadas. O sobrenadante da cultura foi submetido a precipitação por sulfato de amônio e cromatografia de interação hidrofóbica. Duas β-glicosidases foram encontradas, PcβGlu1 e PcβGlu2. Para melhor purificação PcβGlu2 foi submetida à cromatografia de exclusão molecular. PcβGlu1 demonstrou ser mais estável que PcβGlu2 quando colocada a altas temperaturas e as duas apresentaram atividade ótima em pH 5,0. PcβGlu1 e PcβGlu2 possuem massas moleculares nativas de 241 kDa e 95 kDa, respectivamente. A determinação da configuração do carbono anomérico demonstrou que as enzimas atuam sobre seus substratos pelo mecanismo de retenção de configuração. A atividade de PcβGlu2 foi mais inibida pelos íons Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ e Hg + a 10 mM que PcβGlu1. PcβGlu1 demonstrou cinética Micheliana para todos os substratos testados com valores de K M variando de 0.09 ± 0.01 (laminarina) a 1.7 ± 0.1 mM (C2). PcβGlu2 demonstrou inibição pelos substratos MUβGli, pNPβGli, celodextrinas (C3, C4 and C5), octilβGli e Lb, com valores de K M variando de 0.014 ± 0.001 (MUGβGli) a 0.64 ± 0.06 mM (Cb). As duas enzimas foram inibidas de forma competitiva por glicose e de acordo com um modelo de inibição mista por celobiose quando pNPβGli foi utilizado como substrato, sendo PcβGlu2 mais inibida que PcβGlu1. PcβGlu1 foi identificada com 15% de cobertura como produto codificado pelo gene Pc18g01940 e PcβGlu2 foi identificada como produto codificado pelo gene 20g10170 com 3,5 % de cobertura. As duas enzimas possuem maiores afinifidade de ligação para resíduos de glicose nos subsítios -1 e +1. Comparando as duas enzimas, PcβGlu2 possui maior potencial para aplicação em hidrólise de biomassa, visto que foi capaz de hidrolisar biomassas sem a adição de enzimas suplementares.