Indução do promotor GmNAC6 por elicitores de estresses e mapeamento de regiões reguladoras - Rosado, Gustavo Leão (2012)
As proteínas que contém o domínio NAC são específicas de plantas e são representadas por uma família gênica grande de fatores transcricionais implicados em diversos aspectos de desenvolvimento e respostas a estresses. A proteína GmNAC6 foi recentemente identificada como componente downstream da via de sinalização de morte celular mediada pelas proteínas NRPs (N-rich proteins) e induzida por estresses no retículo endoplasmático (RE) e osmótico. Este trabalho teve como objetivo principal caracterizar a atividade do promotor de GmNAC6 em respostas a diferentes estímulos bióticos e abióticos, focando na identificação de possíveis cis-elementos regulatórios que controlam a expressão do gene em resposta a diferentes estresses. Para tanto, a região promotora do gene GmNAC6 (1Kb) foi isolada do banco de dados e fusionada com o gene repórter GUS. Essas construções foram integradas no genoma de plantas de tabaco por meio de transformação mediada por Agrobacterium a fim de avaliar a ativação transcricional do gene GmNAC6 tecido-específica e induzida por diferentes estímulos. Os transformantes primários foram monitorados por PCR e expostos a diferenes hormônios e tratamento de estresses, como tunicamicina, polietileno glicol, cicloheximida, BAP, ácido salicílico, ácido jasmônico e ácido abscísico. Em seguida, a atividade do gene repórter foi avaliada qualitativamente por análise histoquímica e quantitativamente por analise fluorimétrica. Exceto por PEG que não induziu o promotor nos tecidos vasculares do caule, os demais estímulos induziram um padrão uniforme de atividade do promotor NAC6. Contudo o nível de expressão variou com o tipo de tecido. Consistente com o envolvimento de GmNAC6 em morte celular, a atividade de GUS foi mais pronunciada em tecidos mais velhos, exceto por tratamento com ABA que induziu altos níveis de atividade do promoter em folhas jovens. Similarmente, o nível relativo de expressão de GUS pareceu significativamente mais alto em tecidos sob diferenciação. Por meio de deleções de regiões do promotor e analise in sílico de putativos cis-elementos responsivos a estímulos em promotores de plantas, foi possível delimitar módulos discretos no promotor de NAC6 contendo vários elementos regulatórios positivos e negativos com o potencial de influenciar a indução do promotor aos estímulos testados. O promotor em estudo foi induzido por todos os estresses testados, sendo induzido mais fortemente por hormônios que regulam a senescência e a resposta biótica, como ataque de patógenos e ferimento. Foi demonstrado também que o promotor é induzido pelas proteínas NRPs, evidenciando a participação na via integrativa que vai culminar em morte celular. O promotor também foi induzido por NAC32, uma proteína da mesma família NAC e que foi identificada previamente por meio de sua capacidade de interagir com NAC6. Coletivamente esses resultados indicam que a indução do gene NAC6 a diferentes estresses e hormônios ocorre no nível transcricional por meio de módulos discretos do promotor que contem cis-elementos regulatórios positivos e negativos. Além disso, os presentes resultados confirmam a participação de NAC6 como componente da via de resposta a estresses no RE e osmótico, mediada pelas proteínas NRPs.