Purificação e caracterização de uma α-galactosidase em sementes de Tachigali multijuga e clonagem parcial do gene da estaquiose sintase de soja - Fialho, Lílian da Silva (2007)
A soja, devido ao seu alto valor nutricional, é mundialmente consumida na forma de óleo, margarinas, proteína texturizada e extrato hidrossolúvel. O extrato hidrossolúvel, conhecido como leite de soja, é uma alternativa alimentar para muitas pessoas com intolerância à lactose. No entanto, a presença dos galactooligossacarídeos (GO) restringe o consumo de soja e seus produtos derivados. A mucosa intestinal do homem e animais monogástricos não possui a enzima α-galactosidase necessária para hidrolisar as ligações α-1,6 dos resíduos de galactose presentes nos GO, desta forma estes oligossacarídeos não são digeridos causando diarréia, náuseas, e flatulência. Como parte de nosso esforço para aumentar o consumo de soja e produtos derivados pelo homem, este trabalho teve dois objetivos: purificar e caracterizar uma α-galactosidase de sementes de Tachigali multijuga e avaliar sua capacidade de hidrolisar os GO em leite de soja; e isolar, clonar e seqüênciar parte do gene que codifica a enzima estaquiose sintase (STS) de soja, para ser usada para seu silenciamento por técnicas de engenharia genética. A enzima α-galactosidase foi purificada por precipitação ácida, diálise, cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A fração enzimática purificada foi analisada por eletroforese em gel SDS-PAGE e revelou uma única banda protéica com massa molecular de 38 kDa. Atividade máxima da α-galactosidase foi detectada em pH 5,0 - 5,5 a 50 °C. A enzima foi estável no pH 4,5 - 7,0 por 15 min a 40 ºC, mas perdeu total atividade no pH 7,0 por 30 min a 40 ºC. Cerca de 65 % de atividade original foi mantida após préincubação por 200 h a 35 ºC. A meia-vida da α-galactosidase a 40 ºC foi 17,6 h. A α-galactosidase apresentou especificidade absoluta para galactose ligada em posição α, e ela foi completamente inibida por SDS, Hg2+, Cu2+ e Ag+, e parcialmente inibida por D-galactose e melibiose. Os valores de KM para hidrólise do ρNPαGal, melibiose, rafinose e estaquiose foram 0,45; 5,37; 39,62 e 48,80 mM, respectivamente. A α-galactosidase foi inibida competitivamente por galactose quando o ρNPαGal foi usado como substrato, com Ki de 2,74 mM. Os valores de energia de ativação estimados para os substratos ρNPαGal e rafinose foram 13,86 e 4,75 kcal/mol, respectivamente. O tratamento da farinha desengordurada de soja com a α-galactosidase purificada de sementes de Tachigali multijuga resultou em 72 e 50 % de redução do conteúdo de rafinose e estaquiose, respectivamente, após incubação por 4 h a 40 °. A enzima apresentou capacidade para hidrolisar goma de alfarroba e goma guar, sugerindo possível aplicação industrial para promover propriedades gélicas em polissacarídeos. A atividade de STS foi determinada durante o desenvolvimento da semente de soja e em sementes maduras. A quantificação de estaquiose foi feita por HPLC. O conteúdo de estaquiose na soja madura foi 4,10 % e a atividade específica da enzima STS foi 2,15 nkat/mg, usando rafinose e galactinol como substratos. Um fragmento do gene STS foi isolado por PCR usando cDNA de semente em combinação com primers degenerados. A análise do padrão de expressão por RT-PCR mostrou que o gene STS é expresso em todos os estádios de desenvolvimento do grão, além de folhas, caule e raiz. A clonagem de um fragmento de 983 pb no vetor pGEM-T Easy foi confirmada por seqüenciamento. A identidade do fragmento, usando a ferramenta BLAST, confirmou que a seqüência clonada se refere ao gene STS, que até então não tinha sido isolada e seqüenciada em soja. Este trabalho abre perspectivas para pesquisas biotecnológicas visando o desenvolvimento de variedades de soja, com reduzido conteúdo de estaquiose e então mais adequadas para o consumo humano.