Prospecção de peptídeos antimicrobianos de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas - Barbosa, Meire de Oliveira (2008)
Técnicas baseadas em separações por cromatografia líquida bidimensional (TDLC) ou multidimensional (MDLC), acopladas à espectrometria de massa (MS), têm sido utilizadas nas separações de proteínas e de peptídeos para estudos de bioprospecção de atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi a prospecção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas. Extratos de sementes de soja não germinadas (SSNG) e de sementes de soja germinadas por 48 horas (SSG48) foram submetidos ao fracionamento salino, aquecimento seletivo, diálise, cromatografia de troca aniônica (CTI) e de fase reversa (C18 RP-HPLC), seguindo-se análises de MS. Comparações dos perfis cromatográficos (CTI e RP- HPLC) de SSNG e SSG48 sugeriram que diferentes peptídeos estão sendo sintetizados, já que massas moleculares (MM) menores que 10 kDa foram identificadas por MS. Ensaio de biorrevelação com a fração catiônica das SSG48 mostrou que compostos com MM abaixo de 14 kDa foram capazes de inibir o crescimento da bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. Assim, objetivando conhecer melhor as características do conjunto de AMPs de SSG48, foram avaliadas diferentes metodologias utilizando diferentes técnicas de clareamento e de purificação, e um novo protocolo para a prospecção de peptídeos foi proposto, contendo as seguintes etapas: extração, fracionamento com sulfato de amônio (35-75% sat.), ultrafiltração (membranas com volume de exclusão de 30 e 1 kDa), TDLC (cromatografia de exclusão molecular - CEM e C18 RP-HPLC). As frações obtidas após a C18 RP-HPLC foram aquecidas à ebulição para a remoção dos solventes e utilizadas para ensaios de atividade antimicrobiana, SDSTricina- PAGE e MS. Diferentes frações eluídas da C18 RP-HPLC, após o aquecimento, foram ativas contra cinco bactérias fitopatogênicas, tendo sido identificadas MM inferiores a 10 kDa nessas frações. A avaliação da síntese ou da expressão diferencial de AMPs em SSNG e SSG48 evidenciou que SSG48 apresenta um potencial para a identificação de peptídeos de grande importância funcional, possivelmente envolvidos nos processos de defesa. O ajuste de protocolo permitiu um enriquecimento das amostras em AMPs em SSG48, resistentes à alta temperatura e ao contato com acetonitrila e TFA, ainda não descritos, podendo essas características ser exploradas para aplicação biotecnológica na agroindústria. Paralelamente, utilizando ferramentas de bioinformática, foram realizadas buscas em banco de dados (NCBI) visando à identificação de seqüências de DNA que codificam para AMPs em soja. Uma seqüência de uma provável defensina foi obtida e clonada em Escherichia coli. O plasmídeo de expressão (pPIC 9) contendo a defensina foi linearizado e utilizado para a transformação de Pichia pastoris, um transformante His+ foi utilizado para avaliar a expressão da defensina recombinante, e SDS-Tricina-PAGE para verificar a expressão. A avaliação por SDS-Tricina-PAGE não permitiu confirmar a expressão da defensina até o momento, sob as condições utilizadas. A identificação e clonagem de uma possível defensina foram realizadas com sucesso, e sua expressão vem sendo buscada, o que provavelmente possibilitará sua caracterização para aplicações biotecnológicas diversas.