Identificação e purificação de uma β-glicosidase extracelular e construção de vetores para expressão constitutiva de celulases em Kluyveromyces marxianus UFV-3 - Lopes, Mariana Rocha (2011)
Kluyveromyces marxianus é uma levedura com muitas características desejáveis para o desenvolvimento de um eficiente processo de produção de etanol a partir da sacarificação e fermentação simultâneas de biomassas: elevada taxa de crescimento, utilização de uma ampla variedade de açúcares, eficiente sistema de secreção de proteínas e a capacidade de fermentação em temperaturas próximas a 42ºC. A expressão heteróloga de celulases termoestáveis em K. marxianus têm sido o foco de várias pesquisas. O vetor pKLAC1-adh2p, para expressão constitutiva de celulases em K. marxianus, foi construído no Laboratório de Biotecnologia Molecular (LBM/UFV). Neste trabalho o gene de uma β-glicosidase de Aspegillus niger foi clonado e inserido no pKLAC1-adh2p. O cassete de expressão, pKLAC1-adh2p-bgl1, foi utilizado para transformação de K. marxianus UFV-3, porém o processo de seleção não foi eficiente e, durante a triagem por leveduras transformantes, foi observada a capacidade da levedura K. marxianus de secretar uma β-glicosidase. Dessa forma, enquanto trabalhos de padronização de um eficiente sistema de expressão heteróloga em K. marxianus vêm sendo desenvolvidos no laboratório (LBM/UFV), esta β-glicosidase extracelular de K. marxianus foi caracterizada. A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para otimizar o processo de produção e determinar os parâmetros pH e temperatura ótimos para a atividade da β-glicosidase extracelular. As melhores condições do meio para produção foram 4% de glicose, pH 5,5 e incubação a 35°C. A maior atividade enzimática foi obtida em pH 5,5 e 55°C. Ensaios de termoestabilidade determinaram uma meia-vida de 4 horas para a enzima, quando incubada a 60°C. A análise de especificidade por substratos mostrou que a enzima foi capaz de hidrolisar celobiose, p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo, o-nitrofenil-β-Dglicopiranosídeo, p-nitrofenil-β-cellobiosídeo e p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo. A enzima foi purificada por eletroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (PAGE) e análise de zimograma. A análise por SDS-PAGE revelou duas bandas majoritárias em torno de 45 KDa, que foram submetidas à digestão tríptica em gel e analisadas por espectrometria de massas (MS/MS). A proteína foi identificada como uma β-glicosidase. Para finalizar este trabalho, a β-glicosidase foi purificada por ultrafiltração e cromatografia de troca aniônica. O processo de purificação foi acompanhado por ensaio enzimático utilizando p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato e SDS-PAGE. Estes resultados mostram pela primeira vez uma β- glicosidase secretada por uma levedura fermentadora, isto abre a possibilidade para o uso de desta levedura para produção de etanol celulósico, já que os custos com a utilização de celulases ainda inviabilizam economicamente o processo.