Purificação parcial, propriedades e caracterização cinética de proteases tripsina-like do intestino médio da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis - Xavier, Luciana Pereira (2006)
A identificação e caracterização de proteases do intestino médio de insetos são de grande importância para a pesquisa e desenvolvimento de cultivares resistentes às pragas agrícolas. Neste trabalho, foram realizados diferentes processos de purificação para proteases tripsina-like do intestino médio de A. gemmatalis, bem como a caracterização dessas proteases. Duas frações foram isoladas durante um dos processos de gel-filtração, a fração FI (aniônica), com atividade amidásica (substrato: L-BApNA) parcialmente purificada por troca iônica (coluna Mono-Q HR 5/5) e afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) apresentou em SDS-PAGE bandas com massas moleculares de 17,1 kDa a 65,4 kDa; a massa molecular de 17,1k Da provavelmente seja produto de hidrólise e a massa molecular de 65,4 kDa produto de agregação; a fração FII (aniônica) também parcialmente purificada por troca aniônica e afinidade exibiu duas bandas de 33,5 kDa e 31,3 kDa. Ensaio antimicrobiano realizado contra S. aureus e E. coli indicou resultado negativo para o extrato enzimático e para amostra parcialmente purificada de FII. Em ensaio com L. monocystogenes e E. faecalis, o resultado foi positivo para o extrato enzimático e negativo para a amostra parcialmente purificada de FII. Em um segundo processo de purificação, uma serino protease tripsina-like catiônica com massa moleculare de 30 kDa (SDS-PAGE) foi purificada do intestino médio de A. gemmatalis pela combinação de cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina), cromatografia de troca catiônica (coluna Mono-S HR 5/5), em sistema de FPLC e cromatografia de fase reversa (coluna de C-18), em sistema de HPLC. A amostra catiônica parcialmente purificada por afinidade apresentou em SDS-PAGE, bandas com massas moleculares de 24,8 kDa, 26,3 kDa, 30 kDa, 33,4 kDa. A análise com PMSF, TLCK e TPCK, em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, indicou que as eszimas são serino proteases tripsina-like. Em teste de glicosilação, verificou-se que as proteases de 24,8 kDa e de 26,3 kDa são glicosiladas. A atividade específica encontrada foi de 13,2 μM.s-1.μg-1 e o fator de purificação, de 123,4 vezes. Na determinação cinética, o valor de KM app encontrado para as tripsinas-like catiônicas após cromatografia de troca iônica foi de 0,46 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado em cromatografia de fase reversa em HPLC, detectaram-se as massas de 1.750,8 Da (ESI-TOF), 7.997,23 Da (MALDI-TOF) e 23.324,74 Da (ESI-TOF), sugerindo a degradação deste material durante o processamento