Efeitos da deleção de APJ1 em leveduras fermentativas em condições de estresse por etanol - Barros, Géssica Cabral (2018)
O bioetanol é o principal biocombustível utilizado mundialmente e é produzido através da fermentação de açúcares por leveduras. A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada no processo, mas sua incapacidade na fermentação de pentoses levou ao estudo de outras espécies que fermentam pentoses eficientemente, entretanto, estas espécies apresentam baixa tolerância a etanol. Assim, surgiu o interesse de avaliar, em nível de transcriptoma, o papel do silenciamento de APJ1 em S. cerevisiae, e promover sua deleção em Kluyveromyces marxianus, uma vez que trabalhos recentes indicam que sua deleção promoveu aumento da tolerância a etanol. Duas linhagens de S. cerevisiae, BY4741 (wild type) e Y02999 (Δapj1), foram utilizadas para estudo do transcriptoma na presença de 8% (v/v) etanol. Após um período de estresse de duas horas, foram identificados 61 genes up-regulados e 41 genes down-regulados em Y02999. Além destes, 18 genes estavam presentes apenas em Y02999 e 138 genes somente em BY4741. Ao final, oito genes relacionados à tolerância ao etanol e/ou envolvidos com o processo de sumoilação (função relacionada a Apj1p) foram selecionados para validação da diferença de expressão por qPCR, e os genes ARG3 e HSP104 se apresentaram up- regulados e o gene OLE1 se apresentou down-regulado em Y02999 (12% v/v de etanol). Quanto a edição de K. marxianus CCT7735, o sistema CRISPR-Cas9 escolhido para adaptação foi o vetor pML04, desenvolvido para S. cerevisiae. A clonagem do RNA guia neste vetor não ocorreu da forma correta, entrando dois guias no sítio de digestão. Além disso, não foi possível validar a expressão da Cas9 nesta levedura, uma vez que os diferentes primers desenhados para o experimento anelavam de forma inespecífica ao genoma da levedura não transformada. As colônias investigadas por sequenciamento que foram transformadas com esta construção, não apresentaram edição na sequência de APJ1. Apesar do resultado negativo, a ferramenta CRISPR- Cas9 é promissora e cabem mais estudos e ensaios para padronizar a edição em K. marxianus CCT7735.