Produção e caracterização bioquímica de fitases de Rhizopus stolonifer e Aspergillus niger UFV-1 e suas aplicações em ração animal - Monteiro, Paulo Sérgio (2011)
Neste trabalho, duas cepas fúngicas isoladas da castanha macadâmia e de bagaço de cana-de-açúcar foram avaliadas quanto ao potencial para produção de fitases, visando aplicação em processos biotecnológicos, principalmente em rações animais. O fungo Rhizopus stolonifer, isolado a partir da macadâmia, foi cultivado em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20, e CaCl2, utilizando a metodologia de superfície de resposta (MSR) para otimizar a produção de fitases. O uso da MSR resultou em uma atividade enzimática de 0,65 U/mL, valor nove vezes maior em relação à atividade inicial de fitases. A enzima apresentou pH e temperatura ótimas na faixa de 5,0-5,5 e 65 oC, respectivamente, com t1/2 de 50 minutos a 50 ºC. Os valores de KM app e Vmax app foram 0,692 mM e 0,780 Tmol/min, respectivamente. A enzima mostrou-se eficiente na hidrólise de fitato em ração animal, liberando 5,14 Tmol PO4 3-/mL após 5 horas de tratamento. Esse valor é equivalente à concentração inicial de fósforo. O fungo Aspergillus niger UFV-1, isolado de bagaço de cana-de-açúcar, também foi cultivada em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20 e CaCl2. Após oito dias de incubação, o extrato enzimático produzido foi coletado e analisado para a atividade enzimática de fitases. A enzima foi purificada por ultrafiltração, precipitação ácida e cromatografias de troca iônica e gel filtração. A fitase apresentou massa molecular de 161 kDa, determinada por gel filtração e 81 kDa, determinada por eletroforese SDS-PAGE, sugerindo que a enzima é formada por duas subunidades. Os valores de pH e temperatura ótimos foram de 2,0 e 60 ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos, KM e Vmax, determinados pela equação de Lineweaver-Burk, foram 30,9 mM e 7,48 Tmol/min, respectivamente. A kcat estimada foi de 1,46 x 105 s-1 e kcat/KM foi igual a 4724919 s-1.M-1. A fitase mostrou elevada termoestabilidade, com t1/2 de 6,2 horas a 80 ºC e foi resistente a pepsina e tripsina. Além disso, foi eficiente na liberação de fósforo, quando avaliada em ração animal comercial, liberando 15,3 Tmol PO4 3-/mL, valor equivalente a quatro vezes a concentração inicial de fósforo. Os resultados obtidos sugerem que as duas cepas fúngicas avaliadas têm grande potencial como produtoras de fitases para aplicação industrial, principalmente a cepa de Aspergillus niger UFV-1, cuja fitase apresentou pH ótimo ácido e elevada resistência a proteases.