Construção de um vetor viral, baseado no DNA-A do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), para a indução de silenciamento gênico em plantas hospedeiras - Cardoso, Mariana Santos (2009)
Os begomovírus pertencem à família Geminiviridae, que inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidado em partículas icosaédricas geminadas. Os begomovírus são transmitidos pela mosca branca Bemisia tabaci e causam doenças de importância econômica em diversas culturas, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro e relatos esporádicos de incidência na cultura da soja. O silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) é uma alternativa atraente e rápida para o estudo da expressão e função de genes, pois não há necessidade de transformação genética da planta. Vírus com genoma de RNA e de DNA têm sido utilizados com sucesso como vetores para indução de silenciamento gênico em plantas. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e de soja. O objetivo deste trabalho foi a construção de um vetor viral, baseado no DNA-A do begomovírus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), para a indução do silenciamento de genes em plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana. O vetor viral, denominado pToR-A1.4ΔCP, foi construído a partir de um clone infeccioso do ToRMV-A do qual foi removido o gene da proteína capsidial, substituindo pelo sítio múltiplo de clonagem do vetor pBluescript KS+ (pKS+). Assim como outros begomovírus, o ToRMV não requer a proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. Para serem utilizados em experimentos de silenciamento gênico, fragmentos referentes aos genes fitoeno dessaturase (PDS) de soja e tomate, myo-inositol- 1-fosfato sintase (MIPS) de soja e estaquiose sintase (STS) de soja foram isolados a partir de cDNA dessas plantas, utilizando primers específicos, contendo sítios de restrição adequados para as clonagens. Após a amplificação, todos os fragmentos obtidos foram clonados em pGEM-T Easy, sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o algoritmo BLASTn. Para a clonagem no vetor viral, os fragmentos foram liberados do vetor pGEM-T Easy com as enzimas de restrição adequadas, purificados e inseridos no vetor pToR-A1.4ΔCP, previamente clivado em seu sítio múltiplo de clonagem com as mesmas enzimas. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A infecção sistêmica de plantas de soja, tomate e Nicotiana benthamiana pelo vetor pToR-A1.4ΔCP vazio, inoculado conjuntamente com o DNA-B do ToRMV, foi diagnosticada via PCR aos 21 dias após a inoculação. Em N. benthamiana, o vetor viral apresentou 82% de infectividade, indicando um grande potencial de uso em estudos de VIGS nessa planta. Já em plantas de soja e tomate, o vetor viral apresentou baixa taxa de replicação. Portanto, novo teste de infectividade deve ser realizado para confirmar os resultados obtidos. Dessa forma, espera-se que este vetor viral sirva como um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional e na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos.