Utilização de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem para caracterização do genoma de Coffea canephora e C. arabica - Clarindo, Wellington Ronildo (2008)
A aplicação de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem tem possibilitado a caracterização do genoma de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre ex Froehner. Esses trabalhos vêm provendo relevantes informações a estudos evolutivos e para o melhoramento da cultura. Levando em conta a necessidade de ampliação das informações acerca do genoma de C. arabica e C. canephora, esse estudo aprimorou estratégias citogenéticas e citométricas para gerar novos dados acerca do genoma dessas espécies. Inicialmente, metodologias citogenéticas aplicadas em suspensões de agregados celulares de C. canephora geraram cromossomos com morfologia adequada para caracterização morfométrica e montagem do cariograma da espécie. A aplicação das técnicas de bandeamento Ag- NOR e Hsc-FA possibilitaram a identificação da NOR ativa no braço curto do cromossomo 6. Após empregar os mesmos procedimentos utilizados para C. canephora em agregados celulares de C. arabica, foram obtidos cromossomos metafásicos e prometafásicos apresentando resolução suficiente para realização das análises citogenéticas e para montagem do cariograma da espécie. As análises morfométricas evidenciaram tanto cromossomos morfologicamente idênticos quanto diferentes, sugerindo que C. arabica é um alotetraplóide, não segmental, formado a partir do cruzamento de duas espécies com genoma similar. A citometria de fluxo foi empregada para mensurar o conteúdo de DNA nuclear e determinar a composição de bases de C. canephora e C. arabica. Análises preliminares mostraram que os procedimentos envolvendo o uso dos tampões OTTO e de compostos antioxidantes resultaram histogramas apresentando picos de núcleos em G0/G1 com coeficientes de variação considerados adequados para análises citométricas. Além disso, foi demonstrado que, em comparação com Pisum sativum e Raphanus sativus, Solanum lycopersicum foi a planta utilizada como padrão de DNA conhecido que gerou as estimativas mais acuradas acerca do conteúdo de DNA nuclear de C. arabica e C. canephora. Numa segunda etapa foi verificado que o tamanho médio do genoma nuclear de C. arabica (2,62 picogramas) e C. canephora (1,41 picogramas) obtido por meio do fluorocromo iodeto de propídeo foi idêntico ao mensurado com núcleos corados com SYBR Green I. Entretanto, o corante SYBR Green I proporcionou análises citométricas mais precisas, visto que os picos gerados por núcleos na fase G0/G1 apresentaram coeficientes de variação abaixo dos obtidos com iodeto. Além do conteúdo absoluto de DNA, a composição de bases também foi mensurada para as duas espécies utilizando núcleos corados com 4 ,6 -diamidino- 2-fenilindole (DAPI) e cromomicina A3 (CMA3). C. arabica apresentou um percentual de bases AT equivalente a 63,04% e GC 36,96%, enquanto o percentual de base AT de C. canephora foi 65,27% e GC 34,73%. A associação de metodologias citogenéticas e citométricas de fluxo e imagem permitiu estimar o conteúdo de DNA de cada cromossomo de C. arabica e C. canephora. Os resultados obtidos também mostraram que C. arabica é um verdadeiro allotetraplóide e geraram evidências que C. canephora é um possível progenitor dessa espécie. Os dados apresentados forneceram novas informações acerca das características, composição e organização do genoma de C. arabica e C. canephora e representam um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.