Identificação de fatores transcricionais que controlam a expressão do gene sbMATE - Martins, Laura Gonçalves Costa (2016)
O gene SbMATE, que confere tolerância a alumínio em sorgo, é altamente expresso no ápice da radícula e codifica um transportador de membrana pertencente à família MATE (multi drug and toxic compound extrusion family) que é responsável pelo efluxo de citrato ativado por alumínio. A identificação de elementos cis-regulatórios no promotor do gene SbMATE que confere tolerância ao alumínio e de fatores transcricionais que controlam a expressão do referido gene constituem etapas fundamentais para o entendimento do mecanismo de resistência a Al mediado por SbMATE. O objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização de fatores transcricionais que interagem de uma maneira específica com o promotor para controlar a expressão do gene SbMATE. Entre 22 possíveis fatores transcricionais mapeados em um eQTL que influencia a expressão de SbMATE, quatro deles, NF-YB-Like (Sorbic.009g166200), WRKY-like (Sorbic.009g174300), ZincFinger-like (Sorbic.009g151400) e SORBIDRAFT_09g022540, foram selecionados para análise de atividade de regulação de transcrição específica de promotores. Ensaios de mono-híbrido em leveduras demonstraram que a proteína WRKY41-like, mas não NFY-like, interage com o promotor SbMATE isolado tanto de linhagens tolerantes quanto de susceptíveis. A interação ocorre na região proximal (posição -2102 ao ATG) comum a todos os promotores SbMATE testados. Estes resultados foram confirmados em ensaios de transativação de promotores fusionados a GUS em protoplastos de Arabidopsis. Para isso, Arabidopis thaliana ecotipo Col-0 foi inicialmente transformada com construções de DNA, contendo a região proximal ou de fragmentos truncados do promotor SbMATE fusionados à GUS. As folhas das linhagens transgênicas foram utilizadas para o preparo de protoplastos para expressão transiente dos quatro transfatores selecionados. Tanto WRKY-like quanto ZincFinger-like transativaram especificamente o promotor de SbMATE, enquanto que NF-YB-like e SORBIDRAFT_09g022540 não foram capazes de ativar a expressão do gene repórter. Por meio de ensaios de deleção do promotor, os sítios de interação de WRKY-like e ZincFinger- like foram mapeados em um domínio cis-regulatório de 127 pb, delimitado pelas posições -2102 a -1975 no promotor SbMATE. Coletivamente, estes resultados indicam que os transfatores WRKY-like e ZincFinger-like estão envolvidos no controle da expressão do gene SbMATE.