Isolamento e caracterização de genes que codificam poligalacturonases e transformação de Penicillium expansum - Ribeiro, João Batista (2001)
A seqüência completa de nucleotídeos do gene pepg1 foi determinada. A análise desta seqüência mostrou que este gene apresenta dois possíveis introns de 58 pares de bases, um potencial cis elemento TATA na posição -151 e um potencial CAAT Box na posição -273. A região codificadora contém 1110 pb, após a retirada dos introns, e a partir dessa seqüência foi deduzida uma proteína com 370 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos apresenta grande homologia com poligalacturonases de outros fungos filamentosos, com massa molecular deduzida de 38,4 KDa e ponto isoelétrico teórico de 8,31. Quatro fagos recombinantes foram isolados a partir do banco genômico de Pencillium expansum, utilizando-se como sonda um fragmento de DNA de 1,6 Kb contendo o gene pgg1 de P. griseoroseum, os quais foram denominados λPEPG1, λPEPG2, λPEPG3 e λPEPG4. Os fagos λPEPG3 e λPEPG4 apresentaram fragmentos genômicos clonados de 14,5 e 16,6 Kb. Fragmentos de DNA de Bam HI de 3,6 e 5,1 Kb dos fagos λPEPG3 e λPEPG4 respectivamente, que hibridizaram com a sonda, foram subclonados no vetor pBluescript® SK+, originando os plasmídeos recombinantes pEPG3 e pEPG4. O gene pepg1 foi usado na transformação de protoplastos do mutante nia/pab/faw de P. expansum na presença de polietilenoglicol e CaCl2. Para a seleção dos transformantes, em meio mínimo contendo nitrato de sódio como fonte de nitrogênio, foi usado o gene nia de Fusarium oxysporum. Cento e cinqüenta e cinco, dentre os 234 transformantes obtidos, foram considerados estáveis quanto ao gene de nitrato redutase, e foram analisados quanto à produção de pectinase total em meio mineral sólido tamponado contendo pectina. Foram observadas linhagens transformantes apresentando halos de degradação da pectina maiores e menores que os da linhagem selvagem e mutante, mas a maioria dos transformantes apresentou resultado similar ao dessas linhagens. Cinqüenta e três transformantes foram caracterizados quanto à produção de poligalacturonase. Foram observados transformantes com atividade de PG inferior à da linhagem selvagem, mas a maioria dos transformantes analisados apresentou aumento na atividade dessa enzima, variando de 10 a 89 % em relação à linhagem selvagem. A hibridização do DNA total dessas linhagens, clivado com enzimas de restrição, revelou a ocorrência de integração heteróloga e de múltiplas cópias em tandem do gene pepg1 no genoma de P. expansum.