Multiploidia em calos provenientes de anteras de tomate - Julião, Sirlei Aparecida (2012)
A cultura de anteras tem sido aplicada em tomate como tentativa à indução de calogênese seguida da regeneração de plantas haplóides e duplo-haplóides. Por meio desta técnica, linhas homozigóticas podem ser obtidas, o que tem sido considerado relevante para programas de melhoramento e técnicas moleculares. A resposta androgenética pode ser influenciada por diversos fatores, destacando-se, dentre eles, o estádio de desenvolvimento da microsporogênese. Nesta perspectiva, este estudo adaptou um protocolo associando técnicas de citometria de fluxo e citogenética para relacionar as fases de desenvolvimento da microsporogênese em anteras de tomate com o tamanho das mesmas. O objetivo desta associação foi selecionar perfis de anteras a serem inoculadas em meio de cultura. Posteriormente, adaptou-se um protocolo de citometria de fluxo para os calos obtidos in vitro, a fim de monitorar o nível de ploidia de DNA. As suspensões nucleares analisadas pela citometria de fluxo foram obtidas com digestão das anteras e posterior homogeneização das células usando um mini mixer. Os histogramas obtidos mostraram baixos CV s, sendo considerados adequados para a análise citométrica. Dessa forma, anteras pequenas (0,5 0,7 mm), na fase de intérfase/prófase I, apresentaram um perfil de histograma semelhante ao observado em folha diplóide, e anteras grandes (1,6 1,9 mm) na fase de tétrades e micrósporos apresentaram um pico haplóide e um aumento em G2 em função da presença de tétrades. A partir destas análises, as anteras de botões florais de 1 5 mm, com tamanho correspondente aos daquelas analisadas por citometria de fluxo e citogenética (0,5 1,9 mm) foram inoculadas em meio de indução de calogênese, visando identificar as fases mais responsivas a esta condição in vitro. O meio MS basal, suplementado com 2 mg L-1 de AIA e 1 mg L-1 de 2 ip, induziu 21,7% de calogênese, e o maior percentual de calos foi obtido a partir de anteras de botões florais com 2,0 3,9 mm, correspondendo às fases prófase I a anáfase II. Os calos foram analisados pela citometria de fluxo a fim de identificar a ploidia de DNA. O chopping realizado nos calos proporcionou o isolamento dos núcleos, e histogramas com CV s considerados adequados foram obtidos. A análise citométrica evidenciou que todos os calos eram multiplóides, sendo que cada um apresentou uma das cinco classes de níveis de ploidia de DNA, a saber: 2C-4C-8C-16C; 2C-4C-8C-16C-32C; 4C-8C; 4C-8C-16C; 8C-16C-32C. Um total de 44,4% dos calos analisados apresentaram cinco níveis de ploidia de DNA. Um teste estatístico de interação mostrou que o tamanho dos botões florais não influenciou na poliploidização ocorrida nos calos. Estes dados evidenciam a ocorrência de variação somaclonal que, provavelmente, é resultado da interação do genótipo com os reguladores de crescimento acrescidos ao meio de indução.