Vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos e seu efeito na taxa de maturação "in vitro" - Martins, Rodrigo Duarte (2004)
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos, utilizando diferentes tempos e concentrações de etilenoglicol (EG) no equilíbrio, com a solução de vitrificação contendo o EG associado com dois dissacarídeos. Avaliou-se a influência de cada tratamento sobre a taxa de maturação dos ovócitos, após o descongelamento. O experimento foi realizado no LRA-DVT-UFV. Foram testados três soluções de equilíbrio (SE), contendo 3, 20 ou 40% de EG, três tempos de equilíbrio (TE), 0,5, 5 e 15 minutos, e duas soluções de vitrificação (SV), contendo 40% de EG + 1,0 mol L-1 de trealose ou 40% de EG + 1,0 mol L-1 de sacarose. As três SE, os três TE e as duas SV foram combinadas entre si, perfazendo um total de 18 tratamentos. O tratamento controle continha ovócitos frescos não congelados, maturados in vitro. Foram utilizados 2.103 ovócitos imaturos, distribuídos em 19 tratamentos. Os ovócitos selecionados foram mantidos imersos na SE (meiobase com 3, 20 ou 40% de EG) por um determinado TE (0,5, 5 ou 15 minutos). Após o término do TE os ovócitos foram tranferidos para a SV (meio-base com 40% de EG e 1,0 mol L-1 de trealose ou 40% de EG e 1,0 mol L-1 de sacarose), por um minuto. Durante este tempo, os ovócitos foram envasados em palheta de 0,25 mL e colocados diretamente no nitrogênio líquido. Os ovócitos foram descongelados por meio da exposição das palhetas por cinco segundos ao ar, seguida da imersão em Banho Maria a 37 °C por 30 a 45 segundos, e reidratados gradativamente em soluções de trealose (para os tratamentos 1 a 9) ou sacarose (para os tratamentos 10 a 18). Após a reidratação, foi avaliado a taxa de recuperação e a morfologia dos ovócitos.Os ovócitos foram cultivados durante 22 a 24 horas. Observou-se que a SE, TE e a SV não influenciaram a taxa de recuperação, mas influenciaram a morfologia dos ovócitos. A SE que continha 40% EG proporcionou maior taxa de ovócitos normais (OVNORM) (76,94%). O TE de 15 minutos proporcionou maior taxa de OVNORM (80,58%) e menor taxa de ovócitos com retração citoplasmática (OVRET) (16,02%). As soluções de vitrficação contendo a trealose também proporcionaram maior OVNORM (76,80%) e menor OVRET (19,93%). As combinações TE por 15 minutos e SE com 3, 20 ou 40% de EG proporcionaram as menores OVRET (17,40; 20,78 e 9,88%, respectivamente). A combinação (tratamento 14) SV com sacarose, TE por cinco minutos, SE com 20% de EG proporcionou a maior taxa de MII (metáfase II) (44,55%). As piores taxas de MII para os ovócitos dos tratamentos que envolveram a sacarose, foram encontradas nas combinações de SE com 40% de EG e TE por 15 e 5 minutos (0,95 e 0,00%, respectivamente). A maior taxa de MII para os ovócitos dos tratamentos que envolveram a trealose foi de 5,32%. As maiores taxas de CC (condensação da cromatina) foram observadas nos tratamentos que envolveram a trealose. Observou-se que a taxa de MII do tratamento 14 foi significativamente diferente do tratamento controle (44,55% e 74,95%, respectivamente). Conclui-se que a avaliação morfológica de ovócitos imaturos após o descongelamento e reidratação, com base na retração citoplasmática, não reflete o verdadeiro potencial de maturação in vitro dos ovócitos. O uso da trealose na SV influenciou negativamente a maturação ovocitária. O uso da sacarose na SV influenciou positivamente a maturação ovocitária. Concentrações elevadas de EG (40%) associado a um longo TE (cinco e 15 minutos) não favoreceram o desenvolvimento ovocitário. O protocolo utilizando 20% de EG na SE, com TE de cinco minutos e com a SV contendo 40% de EG + 1,0 mol L-1 de sacarose, proporcionou índices razoáveis de maturação in vitro, para ovócitos imaturos de bovinos.