Purificação e caracterização de proteases digestivas tripsina-like do intestino de lagarta da soja, envolvidas no mecanismo de interação planta-inseto - Reis, Denise Torres da Cruz (2009)
A Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), conhecida como lagarta da soja, é considerada a principal praga desta cultura, causando enormes prejuízos devido ao ataque herbívoro. Os danos causados pelo ataque da lagarta associados à relevância econômica do cultivo da soja para o Brasil, fomentam a busca por alternativas no controle deste inseto. Devido à importância das proteases digestivas na fisiologia das larvas, o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. A redução da atividade proteolítica através da ingestão de inibidores de proteases, seja por incorporação na dieta ou uso de plantas geneticamente modificadas, compromete a digestão e reflete em efeitos não apenas no crescimento e desenvolvimento das larvas, mas também na fertilidade e fecundidade do adulto. Entretanto, alguns insetos são capazes de desenvolver mecanismos de resistência à presença dos inibidores, envolvendo as próprias proteases digestivas. Torna-se evidente que uma análise caso a caso, partindo do conhecimento do processo digestivo básico do inseto alvo e das enzimas que compõem seu repertório digestivo são fundamentais para que as estratégias de controle que atuam via intestino sejam bem sucedidas pois, desta forma, a seleção ou desenho de inibidores mais específicos e eficientes pode ser alcançada. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a purificação e a caracterização de enzimas digestivas tripsina-like de Anticarsia gemmatalis. Extratos enzimáticos solúvel e não solúvel foram obtidos a partir do intestino de larvas do 5° instar de Anticarsia gemmatalis, mantidas em dieta artificial. Após concentração por ultrafiltração ambos os extratos foram submetidos à cromatografia de afinidade em coluna de p-aminobenzamidina agarose e posteriormente à cromatografia de troca aniônica, obtendo-se as enzimas após a eluição com gradiente salino (NaCl 0 a 1 mol.L-1).O rendimento da enzima presente no extrato solúvel (enzima tripsina-like solúvel) foi de 52% e a atividade específica final de 26,75 μmol.L-1.min-1/mg. A enzima presente na fração não solúvel (enzima tripsina-like ligada à membrana) foi solubilizada com uso detergente (CHAPS) e após as etapas de purificação apresentou um rendimento de 11% e atividade específica de 18,61 μmol.L-1.min-1/mg proteína. A massa molecular determinada para a enzima solúvel e para a enzima ligada à membrana foi 24,9 kDa(SDS-PAGE) e 28.632 Da (MALDI-TOF), respectivamente. Ambas as enzimas apresentaram atividade proteolítica em gel de substrato contendo caseína. Devido ao baixo rendimento e atividade específica, a caracterização cinética da enzima ligada à membrana não foi realizada. A atividade máxima da enzima tripsina-like solúvel foi detectada em pH 9,0 e a 35°C utilizando-se L-BApNA como substrato e em pH 8,0 e a 25°C utilizando-se L-TAME. Os valores de KM obtidos para os substratos L-BApNA e L-TAME foram de 0,12 mmol.L-1 e 49 μmol.L-1, respectivamente. A enzima solúvel foi inibida por PMSF, TLCK e benzamidina, mas não pelo TPCK, confirmando sua classificação como enzima tripsina-like. A atividade enzimática da enzima solúvel não foi afetada pela presença de íons cálcio (0 a 20 mmol.L-1). Os inibidores proteicos da soja, SBTI e SBBI reduziram a atividade em até 80% na maior concentração testada, 0,1 μmol.L-1 e 0,5 μmol.L-1 , respectivamente, tornando-os candidatos aos ensaios de inibição in vivo. A identidade da enzima solúvel não pôde ser estabelecida através da busca por homologia dos peptídeos trípticos em banco de dados pelo MASCOT, embora o maior score obtido tenha sido com uma enzima tripsinalike de outro inseto da mesma ordem (Lepidoptera). A semelhança nos perfis eletroforético e cromatográfico das enzimas solúvel e ligada à membrana suscita a possibilidade da forma ligada à membrana ser precursora da forma solúvel como já foi descrito em outros insetos. Através do conhecimento produzido neste trabalho surgem perspectivas para a realização de pesquisas complementares que poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle de pragas baseadas na inibição de proteases digestivas.