Clonagem, avaliação de SNPs e expressão heteróloga da ATP Difosfohidrolase 2 (NTPDase 2) das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis - Torres, Nancy da Rocha (2017)
As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos. Apresentam diferentes formas de manifestações clínicas de acordo com a espécie envolvida, podendo apresentar sintomatologia mais severa correlacionada à infecção por cepas mais virulentas. Estudos indicam que L. braziliensis, principal agente da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Brasil, possui uma diversidade intra-espécie e que diferentes cepas estão relacionadas a diferenças na virulência, podendo influenciar o desenvolvimento de diferentes formas clínicas. Foi observado que as cepas ET e NSL apresentam características polares quanto à virulência e infecciosidade em modelo murino. Além disso, foi observado que essas cepas diferem na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e que a alta taxa de hidrólise de ATP se correlaciona com a cepa NSL, de maior virulência. O mesmo trabalho identificou a presença de SNPs não silenciosos na sequência da NTPDase2 de NSL, mas nenhuma correlação com a atividade de hidrólise de nucleotídeos, virulência e infectividade foi observada. Considerando papel das NTPDases de Leishmania na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e na modulação da resposta imune do hospedeiro, o objetivo desse trabalho consistiu em investigar a relação desses polimorfismos com a atividade da enzima NTPDase2, visando compreender as diferenças de hidrólise de nucleotídeos e virulência previamente observados. Nesse trabalho, a região que codifica para o ectodomínio da enzima NTPDase2 das cepas ET e NSL foi isolado e clonado em vetor bacteriano e a sequência correspondente ao ectodomínio de ET/NSL-NTPDase2 foi clonada no vetor pET21b, expressa e purificada. Análises de polimorfismos nas sequências indicam que os clones ET apresentam apenas SNPs silenciosos nas posições 861 e 879. Diferentemente, alguns clones NSL apresentam sequência idêntica à de ET e outros possuem SNPs nas posições 213, 296, 377, 554 e 1126, mudando os aminoácidos nas posições 99, 126, 185 e 376. Avaliando a estrutura 3D das proteínas, foi observado que a maioria das mutações são externas à enzima e que a mutação T376A se localiza em uma região predita como importante para a ligação ao substrato. Juntos, esses resultados levantam questões importantes acerca da influência desses SNPs na estrutura e atividade da enzima, que podem nortear experimentos futuros, a fim de elucidar o papel de variantes genéticas para a enzima NTPDase2 nos fenômenos observados para essas duas cepas em L. braziliensis.